Colorations histologiques utilisant des sections de tissus flottant librement

Cette technique de flottaison libre peut être utilisée pour effectuer une immunohistochimie réduite sur des échantillons de tissu cérébral de souris. La technique du free floating offre plusieurs avantages. L’acquisition de coupes de tissus plus épais, la réalisation d’études à grande échelle, avec 30 à 40 coupes par aliquote et le stockage à long terme des échantillons.

Si vous essayez cette technique pour la première fois, nous vous recommandons de vous entraîner à monter des sections qui ne sont pas essentielles à votre expérience afin d’acquérir de l’expérience avec la méthode. Au moins une à deux heures avant la section, acclimatez les échantillons d’intérêt dans le cryostat à la température de coupe de tissu appropriée. Lorsque les tissus sont prêts.

utiliser le cryostat pour acquérir des sections de 20 à 50 microns d’épaisseur et placer les sections dans des inserts individuels dans des puits remplis de PBS d’une plaque à six ou 12 puits. Lorsque toutes les sections ont été acquises, couvrez les échantillons d’environ six millilitres par lavage pendant trois lavages de cinq minutes avant de transférer chaque puits de sections dans deux microtubes à centrifuger d’un millilitre, contenant un à 1,5 millilitre de solution de stockage par tube. Conservez ensuite les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient colorés.

Pour la coloration des coupes tissulaires, équilibrez les échantillons à température ambiante pendant 10 à 20 minutes avant de décanter les sections en inserts dans une nouvelle plaque à six puits. Lorsque toute la solution de stockage a été vidangée, déplacez les inserts dans de nouveaux puits, contenant environ six millilitres de TBS par puits pour trois lavages pendant cinq minutes avec du TBS frais par lavage sur un agitateur orbital à basse vitesse à température ambiante. Après le dernier lavage, ajoutez sept millilitres de solution de perméabilisation bloquante fraîchement préparée dans chaque puits pour une incubation de 30 minutes sur le shaker à température ambiante.

À la fin de l’incubation, ajouter un millilitre de la solution d’anticorps primaire d’intérêt dans un microtube à centrifuger de deux millilitres par insert et transférer toutes les sections de chaque insert dans le tube de deux millilitres approprié. Placez ensuite les tubes sur un mélangeur rotatif. Ajoutez environ sept tours par minute pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius.

Le lendemain matin, décantez les sections de chaque tube en inserts de puits individuels dans une nouvelle plaque à six puits et lavez les sections deux fois pendant 30 secondes par lavage et une fois pendant 10 minutes dans du TBS frais par lavage. Après le dernier lavage, transférez les groupes de sections dans des microtubes à centrifuger individuels de deux millilitres, contenant un millilitre de la solution d’anticorps secondaire appropriée par tube et incubez les échantillons pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur orbital à basse vitesse, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, décantez les sections en inserts dans une nouvelle plaque à six puits et lavez les échantillons deux fois pendant 30 secondes et une fois pendant 15 minutes dans du TBS frais par lavage, à l’abri de la lumière.

Après le dernier lavage, décantez les sections dans une chambre histologique rectangulaire en verre, remplie aux trois quarts de TBS et immergez une lame de verre dans le TBS. À l’aide d’un pinceau fin et d’une lampe loupe si vous le souhaitez, cajolez soigneusement les sections vers la lame et tapotez doucement une section sur la lame, en vous assurant qu’il n’y a pas de rides ou de plis. Lorsque toutes les sections ont été capturées sur une lame, laissez les lames sécher pendant environ 10 à 15 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière, jusqu’à ce que les sections soient opaques et appliquez un milieu de montage aqueux approprié sur les sections.

À l’aide d’une pince à épiler, placez une lamelle sur le support et utilisez un morceau de papier filtre pour appuyer fermement sur la lamelle afin d’enlever tout excès de support. Les coupes peuvent ensuite être imagées à l’aide d’un microscope approprié ou stockées dans une boîte de lames sombre réglée à quatre degrés Celsius. Comme observé dans ces images représentatives, l’analyse immunohistochimique fluorescente, utilisant la méthode de flottaison, peut être effectuée sur des coupes de tissu cérébral de souris pour examiner l’expression des protéines acides fibrillaires gliales.

Cette approche est également appropriée pour révéler des protéines de faible expression, telles que la GFP, dans un échantillon de cerveau de souris transgénique à faible expression ou dans des protocoles de coloration histochimique non fluorescents, tels que le violet de crésyle. D’autres tissus périphériques se prêtent également à l’utilisation de cette technique sans qu’aucune modification ne soit requise, comme cela a été observé pour ces échantillons de tissus hépatiques exprimant de faibles niveaux de GFP. La chose la plus importante à retenir avec la technique de flottaison libre est d’être doux avec les sections, en particulier lors des transferts et lorsque les échantillons sont sur les agitateurs ou les rotateurs.

En plus d’une coloration par immunofluorescence, cette méthode peut être facilement modifiée pour d’autres colorations histochimiques telles que l’hématoxyline et l’éosine et le violet de crésyle ou pour l’immunohistochimie chromogène.