Imagerie optique basée sur des photodiodes pour l’enregistrement de la dynamique des réseaux avec une résolution mononeurone chez les invertébrés non transgéniques

Cet article représente une description détaillée de la façon d’utiliser un réseau de photodiodes et des colorants sensibles à la tension pour enregistrer les potentiels d’action d’un grand nombre de neurones simultanément. Par rapport à l’imagerie calcique de l’activité neuronale, qui est indirecte, les colorants sensibles à la tension que nous utilisons enregistrent des potentiels d’action directement similaires aux enregistrements d’électrodes nettes, mais à travers de nombreux neurones simultanément. Notre flux de travail d’imagerie optique peut être adapté pour visualiser rapidement l’activité du réseau avec une résolution de neurone unique et de potentiel d’action unique dans une variété de systèmes d’invertébrés et même de vertébrés non transgéniques.

De plus, Evan Hill, de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures de notre protocole. Commencez par anesthésier un animal Aplysia californica de 40 grammes et épinglez-le côté ventral vers le haut dans une boîte de dissection doublée de cire. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une incision médiane de deux à trois centimètres le long de l’extension la plus antérieure du pied et épinglez les rabats du pied de chaque côté de l’incision pour révéler une partie du système nerveux central et de la masse buccale.

Utilisez des pinces et des ciseaux de dissection pour disséquer soigneusement la masse buccale, révélant les ganglions cérébraux, et sectionnez les nerfs innervant le corps de l’animal pour exciser le système nerveux central, laissant une grande longueur du nerf à stimuler. Utilisez des broches minutieuses pour positionner le système nerveux central dans un plat rempli de sérum physiologique doublé d’élastomère et perfuser le plat avec de la solution saline passée à travers un dispositif de refroidissement Peltier pour maintenir la température de préparation à 15 à 16 degrés Celsius. Utilisez les pinces et les ciseaux de microdissection pour retirer l’excès de tissu conjonctif des nerfs et disséquer une partie superficielle de la gaine sur le ganglion ou les ganglions à imager.

Ensuite, trempez le système nerveux central nettoyé dans une solution de glutaraldéhyde à 0,5 % dans une solution saline pendant 20 secondes avant de remettre le système nerveux central dans le plat doublé d’élastomère imprégné de solution saline pour rincer tout excès de glutaraldéhyde. Pour préparer une solution de travail de colorant sensible au voltage, ajoutez 500 microlitres de solution saline à une aliquote solide de RH 155 préalablement préparée pour obtenir une concentration finale de colorant de 0,3 milligramme par millilitre. Et utilisez un microdistributeur portable pour charger 200 microlitres de solution dans un morceau de tube en polyéthylène d’un diamètre similaire à celui du ganglion à colorer.

À l’aide d’un micromanipulateur, placez soigneusement l’extrémité du tube sur le ganglion cible, en abaissant le tube jusqu’à ce qu’il forme un joint bien ajusté sur le ganglion. Tournez le bouton de l’applicateur du microdistributeur toutes les cinq minutes pendant une heure pour forcer plus de colorant sur le ganglion, en vérifiant l’échantillon au bout de 30 minutes pour confirmer qu’une coloration adéquate se produit. Après la coloration, en gardant les lumières tamisées, placez un matériau tampon approprié à gauche et à droite de l’endroit où la préparation sera placée dans la chambre d’imagerie contenant du sérum physiologique, puis plongez le système nerveux central dans la chambre.

Appuyez sur un morceau de lamelle de taille appropriée sur le tissu et appuyez fermement sur la lamelle pour aplatir le tissu sans endommager les neurones. Placez ensuite la chambre d’imagerie sous un microscope à dissection. Si vous stimulez un nerf pour provoquer un programme moteur fictif, faites fondre soigneusement un segment de tube en polyéthylène PE100 sur une flamme tout en tirant doucement les deux extrémités du segment de tube et coupez le cône résultant à l’endroit souhaité.

Ensuite, fixez une longueur de tube en polymère flexible à paroi épaisse à l’extrémité arrière d’une électrode d’aspiration en polyéthylène. Ensuite, utilisez une section buccale pour créer une pression négative et aspirez un petit volume de solution saline à travers l’extrémité effilée de l’électrode d’aspiration. Dessinez l’extrémité du nerf à stimuler dans l’électrode au microscope et confirmez que la solution saline dans l’électrode ne contient pas de bulles qui pourraient interrompre la conduction électrique.

Pour l’imagerie du ganglion, déplacez la chambre vers le banc d’imagerie et amorcez la perfusion saline à travers la chambre d’enregistrement. Placez une sonde de température près de la préparation et réglez la température en fonction de l’espèce imagée. Placez un fil d’argent chloré dans l’électrode d’aspiration, en vous assurant qu’il entre en contact avec la solution saline dans l’électrode et placez un fil de chlorure d’argent dans la solution saline du bain près de l’électrode d’aspiration.

Abaissez la lentille d’immersion dans l’eau saline et fermez le diaphragme de base. Soulevez ou abaissez le condenseur du sous-étage et ajustez la mise au point jusqu’à ce que les bords du diaphragme soient nets, créant ainsi un éclairage Kohler. Concentrez-vous sur la région de la préparation à imager et acquérez une image du ganglion d’intérêt avec la caméra numérique parfocale.

Réglez le commutateur de gain du panneau de commande sur 1X et cliquez sur le bouton d’intensité de la lumière au repos pour vérifier l’intensité moyenne de la lumière au repos des diodes. Ajustez le niveau de tension envoyé d’un stimulateur à l’alimentation de la lampe LED et continuez à vérifier le niveau moyen d’intensité lumineuse au repos jusqu’à ce qu’il se situe dans la plage souhaitée. Réglez ensuite le commutateur de gain du panneau de commande sur 100X pour l’enregistrement et vérifiez que le ressort ou la table à air flotte.

Alors que les voyants sont toujours éteints, définissez la durée, le chemin et le nom du fichier dans le logiciel d’imagerie et cliquez sur Prendre les données pour acquérir des fichiers jusqu’à la capacité de la RAM disponible de l’ordinateur. Veillez à rester immobile pendant l’enregistrement, car de petites vibrations peuvent introduire de gros artefacts dans les données d’enregistrement optique. Pour afficher les données immédiatement après l’acquisition, utilisez la fonction superposée pour superposer les données collectées par les 464 diodes sur l’image du ganglion et cliquez sur l’une des diodes représentées dans le logiciel pour développer les données enregistrées sur un écran de trace séparé.

Pour obtenir un alignement exact des diodes par rapport à la préparation, entrez les facteurs X, Y et de grossissement déterminés par un test de sténopé. Pour maximiser la visibilité du potentiel d’action et améliorer le rendement neuronal pour le tri ultérieur des pointes, imposez un filtre Butterworth passe-bande avec des coupures de cinq et 100 Hertz pour supprimer le bruit à basse et haute fréquence. Pour enregistrer les données optiques filtrées sous forme de fichier texte en vue d’une analyse ultérieure, sur l’écran de la page, sélectionnez la case de filtre TP.

Et sous l’onglet Sortie, sélectionnez Enregistrer la page au format ASCII. Entrez ensuite un nom de fichier approprié dans la boîte de dialogue qui s’affiche. Le contact de la peau avec son prédateur étoile de mer déclenche la nage d’évasion de Tritonia diomedia, composée d’une série rythmée de flexions de tout le corps qui le propulsent vers la sécurité.

Dans cette figure, les données brutes et filtrées de 20 diodes enregistrant l’activité avant, pendant et après la stimulation du nerf pédalier trois sont présentées. Immédiatement après l’acquisition, les signaux mesurés par les 464 diodes du réseau d’enregistrement peuvent être affichés topographiquement sur une image de la préparation dans le logiciel d’imagerie. Dans cette analyse, le tri par pointe des traces de diodes filtrées avec l’analyse en composantes indépendantes, ou ICA, a donné 53 traces neuronales uniques, dont 30 sont présentées ici.

Un stimulus de queue fortement aversif à Aplysia californica suscite des vagues répétées d’une réponse d’évasion rythmique en deux parties consistant en une période de galop de plusieurs cycles de fentes de la tête et de tractions de la queue qui font avancer rapidement l’animal et une période de rampement ultérieure. Dans cette analyse représentative, une minute après le début d’un enregistrement optique continu de 20 minutes, le nerf de la pédale neuf a été stimulé pour déclencher la séquence de programme moteur galop-crawl. Les distributions spatiales gaussiennes probabilistes des signaux des 81 neurones enregistrés ont été cartographiées sur le ganglion.

La réduction de la dimensionnalité appliquée à l’enregistrement complet a révélé que les phases de galop et de rampement du programme d’évasion occupaient des zones distinctes et formaient des trajectoires différentes dans l’espace des composantes principales. Lors de l’essai de ce protocole, les considérations importantes comprennent : l’optimisation de la coloration, la minimisation des vibrations et l’acheminement de suffisamment de lumière à travers la préparation vers le PDA tout en minimisant le photoblanchiment du colorant. Parmi les exemples d’analyse post-acquisition qui ont révélé des informations sur le réseau au niveau de la population, citons la détection d’ensembles fonctionnels via le regroupement consensuel dans un algorithme d’apprentissage non supervisé et la réduction de la dimensionnalité à l’aide de l’analyse en composantes principales.

La combinaison de notre système d’imagerie basé sur un réseau de photodiodes et de notre utilisation de colorants absorbants sensibles à la tension permet de surveiller l’évolution dynamique du réseau sur de longues durées.