Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Les BMEC générées à partir d’iPSC fournissent de nouveaux modèles expérimentaux pour étudier le fonctionnement et le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé ce protocole pour examiner si les BMEC conservent leurs propriétés de barrière après l’expansion et la cryoconservation. Cette technique permet de générer des BMEC spécifiques à la maladie à partir de patients atteints de troubles dans lesquels la perturbation de la barrière hémato-encéphalique joue un rôle dans la physiopathologie de la maladie.

Pour induire la différenciation BMEC des iPSC humaines, lavez une fois la culture confluente d’iPSC avec DPBS avant d’incuber les cellules avec le volume approprié d’EDTA enzymatique pendant environ cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsqu’une suspension unicellulaire a été obtenue, prélever les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans un volume approprié de milieu de cellules souches complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK pour le comptage. Diluez les cellules à 1,56 fois 10 puissance quatre cellules par centimètre cube de concentration et ensemencez deux millilitres de cellules dans des puits individuels d’un fond plat à six puits.

Après 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, remplacez le surnageant dans chaque puits par un milieu E6 et remettez la plaque dans l’incubateur pendant quatre jours supplémentaires. Pour purifier les BMEC dérivés d’iPSC, enduisez les plaques de sous-culture avec le volume approprié d’une solution de collagène IV et de fibronectine fraîchement préparée par puits et incubez les plaques pendant au moins deux heures à 37 degrés Celsius. Au sixième jour de la différenciation, collectez les cellules par centrifugation et remettez les granules en suspension dans le volume approprié de milieu endothélial humain frais sans sérum complété par B27, le facteur de croissance des fibroblastes basiques et l’acide rétinoïque.

Pour l’analyse TEER, placez les cellules différenciées dans chaque puits d’une plaque filtrée à 12 transpuits enrobée de collagène et de fibronectine. Pour l’analyse de l’activité du transporteur d’efflux, plaquez les cellules dans chaque puits d’une plaque à fond plat à 24 puits recouverte de collagène et de fibronectine. Après 24 heures de sous-culture, remplacez le surnageant dans chaque puits par un milieu frais sans sérum endothélial humain complété uniquement par un supplément de B27.

Pour mesurer les propriétés de la barrière hémato-encéphalique des BMEC à l’aide de TEER, chargez l’instrument TEER pendant la nuit et essuyez légèrement l’instrument et les électrodes de la baguette avec de l’éthanol à 70 % avant de les placer dans le capot de sécurité. Mettez l’appareil de mesure sous tension et calibrez l’ohmmètre selon les spécifications du fabricant. Branchez les électrodes et rincez-les une fois avec de l’éthanol à 70 % et une fois avec du DPBS.

Placez l’extrémité la plus courte de l’électrode dans la chambre atypique de l’insert et l’extrémité la plus longue dans la chambre basolatérale d’un puits vierge. Après avoir mesuré la réponse du contrôle négatif, rincez rapidement les électrodes comme démontré et mesurez le premier puits expérimental. Une fois que toutes les mesures ont été enregistrées, rincez à nouveau les électrodes des baguettes, essuyez doucement les électrodes et laissez-les sécher à l’air libre dans le capot de sécurité.

Pour évaluer l’activité du transporteur d’efflux des cellules, le huitième jour de la culture, traitez le nombre approprié de puits avec une solution inhibitrice de 10 micromolaires de transporteur d’efflux et placez-les dans un incubateur pendant une heure à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, traitez les cellules avec une solution de substrat de transport d’efflux de 10 micromolaires pendant une heure dans l’incubateur. À la fin de l’incubation, laver chaque puits deux fois avec 500 microlitres de DPBS par puits avant de lyser les cellules avec 500 microlitres de DPBS complétés par 5 % de Triton-X par puits.

Après cinq minutes, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer la fluorescence des cellules lysées à une excitation de 485 nanomètres et une émission de 530 nanomètres. Pour les puits non utilisés dans l’essai de transporteur, laver les cellules deux fois avec du DPBS avant de les fixer avec une quantification de 4 % de paraformaldéhyde par noyau cellulaire. Après une journée de culture en milieu E6, la morphologie cellulaire est similaire à celle des iPSC.

Au quatrième jour, les cellules sont visiblement distinctes des iPSC et couvrent la majeure partie du puits. Deux jours de culture dans un milieu endothélial humain sans sérum induisent un aspect allongé et pavé dans les cellules. Au huitième jour, les cellules individuelles forment un motif de pavés principalement gros.

Un test de germination peut être effectué pour démontrer le potentiel angiogénique des BMEC dérivés d’iPSC. Cela conduit au développement de structures tubulaires après trois jours de traitement par facteur de croissance. Les BMEC dérivées d’iPSC générées à l’aide de ce protocole ont co-exprimé les protéines de jonction serrée exprimées dans les cellules endothéliales du cerveau, des poumons, du foie et des reins, ainsi que les marqueurs endothéliales vasculaires exprimés à la barrière hémato-encéphalique.

Comme on l’a observé, 48 heures après la sous-culture et le changement de milieu, les BMEC dérivées d’iPSC présentent des valeurs TEER dans la plage décrite pour les BMEC dérivées d’iPSC qui ont été co-cultivées avec des astrocytes primaires de rats. Une activité de transport d’efflux a également été observée à ce stade. Après cryoconservation, les mesures TEER sont inférieures à celles des BMEC fraîchement dérivés.

L’analyse par transfert Western révèle des niveaux réduits de marqueurs de jonction serrée, tels que l’occludine, tandis que l’immunocytochimie montre des motifs de taches de rousseur et/ou effilochés de protéines de jonction serrée. Une densité d’iPSC trop élevée ou trop faible affectera l’efficacité de la différenciation et aura un impact sur le développement de propriétés appropriées de la barrière hémato-encéphalique. Cette méthode permet d’étudier les propriétés de barrière, la signalisation cellulaire et l’activité du transporteur à l’aide de BMEC individualisés pour modéliser la physiologie et la physiopathologie de la fonction de la barrière hémato-encéphalique.