Name: Visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez la visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique. Cette méthode permet d'étudier l'organisation spatiale des biofilms et leur impact sur la susceptibilité aux antimicrobiens.

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Les auteurs tiennent à remercier la Fondation de la fibrose kystique qui a financé cette recherche et MedImmune pour leur généreux don d’anticorps anti-Psl0096. Dans le cadre de cette étude, l’imagerie a été réalisée au centre d’imagerie CAMiLoD de l’Université de Toronto.

L’approbation du Comité d’éthique de la recherche (CÉR) est requise pour prélever et conserver des échantillons d’expectorations prélevés sur des sujets humains. Les études présentées ici ont été approuvées par le CER#1000058579 de l’Hôpital pour enfants malades.
1. Collecte des expectorations
<ol><li>Conservez les expectorations dans un gobelet de collecte stérile et conservez-les immédiatement à 4 °C pendant un maximum de 24 h avant la fixation. REMARQUE : Laisser les expectorations trop longtemps à 4 °C sans fixation peut entraîner une dégradation cellulaire, en particulier la dégradation des globules blancs. La fixation le plus tôt possible est préférable.</li>
	<li>Transférez les échantillons d’expectorations dans un tube stérile de 15 ml.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) aux échantillons d’expectorations. Par exemple, si l’échantillon d’expectoration est de 0,5 mL, ajoutez 0,5 mL de PFA à 4 %. Mélanger par inversion douce.</li>
	<li>Incuber les expectorations pendant la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Lavez l’échantillon en ajoutant 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à chaque 2 mL d’expectorations fixes. REMARQUE : Aucune centrifugation n’est requise pour cette étape de lavage.</li>
	<li>Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette. REMARQUE : Évitez d’aspirer les expectorations avec la pipette en pointant l’embout loin des expectorations et aspirez très lentement le liquide de surface. L’étape de lavage n’implique pas de centrifugation pour ne pas perturber l’intégrité structurelle des bouchons d’expectoration.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.6 à 1.7 deux fois de plus.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 2 fois le volume de PBS avec 0,01 % (p/v) d’azoture de sodium.</li>
	<li>Conservez les expectorations à 4 °C.</li>
</ol>2. Traitement MiPACT (technique de nettoyage des tissus) des expectorations
<ol><li>Dégazer les composants de l’hydrogel (30 % d’acrylamide 29 :1 : bis-acrylamide, durcisseur et PBS) dans un récipient hermétique contenant une compresse anaérobie pendant 72 h. REMARQUE : Le pack anaérobie et le récipient scellé sont nécessaires car l’oxygène inhibe la polymérisation de l’acrylamide. Alternativement, l’oxygène peut être éliminé en effectuant cette étape dans une hotte anaérobie, en appliquant un vide dans un récipient scellé ou en faisant bouillonner du gaz N2 à travers le mélange d’acrylamide.<ol><li>Ajouter 2 mL d’une solution d’acrylamide :bis-acrylamide 29 :1 à 30 % dans un tube de 15 mL avec le bouchon retiré à l’intérieur du récipient anaérobie scellé.</li>
		<li>Préparez un bouillon concentré de durcisseur à 10 % (p/v) en ajoutant 0,5 g de durcisseur à 5 mL de PBS dans un tube de 15 mL. Laissez le bouchon hors du tube et rangez-le dans le récipient anaérobie scellé.</li>
		<li>Laissez quelques ml de PBS stérile dans un tube, sans bouchon, à l’intérieur du récipient anaérobie.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer une solution de 5 mL d’hydrogel avec une concentration finale de 0,2 % de durcisseur et de 4 % d’acrylamide 29 :1 : bis-acrylamide dans du PBS dans un tube de 15 mL. Mélanger par inversion et filtrer stériliser.</li>
	<li>Retirez les échantillons d’expectorations du réfrigérateur, puis coupez-les en petites sections (environ 5 mm de diamètre) dans des conditions stériles avec un scalpel. REMARQUE : Si les expectorations sont assez fluides, cette étape peut toujours être effectuée, cependant, il faut une patience et une pratique accrues pour retirer les expectorations de la solution de stockage avec une pince à épiler avant d’utiliser le scalpel pour séparer les fractions souhaitées.</li>
	<li>Placez les échantillons d’expectorations coupés à l’intérieur d’un puits d’une lame de verre de protection à 8 chambres.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de solution d’hydrogel stérilisée par filtre de l’étape 2.2 dans chacun des puits contenant des expectorations.</li>
	<li>Placez le verre de protection à 8 chambres à l’intérieur d’un récipient hermétique contenant un pack anaérobie pendant 3 h à 37 °C. REMARQUE : Une fois polymérisé, l’hydrogel avec des expectorations incrustées doit avoir la consistance d’un gel ferme.</li>
	<li>Transférez les échantillons d’expectorations d’hydrogel solidifié dans un tube de culture de 15 mL contenant 5 mL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 8 %, pH 8, et laissez les échantillons s’éclaircir pendant 3 à 14 jours à 37 °C (avec ou sans secousse), jusqu’à ce que les expectorations deviennent transparentes. REMARQUE : Les temps d’élimination dépendent de la composition des expectorations et peuvent généralement être diminués en agitant. Cependant, veillez à ne pas augmenter la vitesse d’agitation au point de perturber l’intégrité de l’échantillon. Les échantillons plus riches en ADN prennent plus de temps à effacer que les échantillons riches en mucus.</li>
	<li>Décanter la solution de SDS à 8 % dans un conteneur de collecte des déchets. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transférez chaque échantillon enrobé d’hydrogel dans un tube conique stérile de 50 ml. Ajouter 10 mL de PBS dans chacun des tubes coniques de 50 mL pour laver les hydrogels et laisser reposer la solution pendant 30 min à 1 h avant de décanter. Répétez cette opération 2 fois de plus. REMARQUE : Cette étape de lavage n’implique pas de centrifugation. L’excès de liquide et le surnageant sont soigneusement éliminés à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Conservez les échantillons lavés dans du PBS avec de l’azoture de sodium à 0,01 % (p/v) et 1x inhibiteur de la RNase à 4 °C.</li>
</ol>3. Protocole d’hybridation in situ fluorescente à l’hydrogel (FISH)
<ol><li>Retirez les échantillons d’hydrogel de leur solution de stockage à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-les sur une surface stérile (comme une lame de verre ou une boîte de Pétri).</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel stérile, coupez les hydrogels en tranches de ~ 1 mm d’épaisseur.</li>
	<li>Placez les sections d’hydrogel de 1 mm dans des tubes stériles de 1,5 ml.</li>
	<li>Préparer 1 mL de tampon d’hybridation (formamide à 25 %, NaCl à 0,9 M, Tris-HCl à 20 mM [pH 7,6], SDS à 0,01 %, H2O purifié et déminéralisé) dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter la sonde PseaerA marquée par fluorescence (150,7 nM12) dans le tampon d’hybridation et mélanger par inversion. REMARQUE : La solution de formol doit être tenue à l’écart d’une flamme nue. Le tampon d’hybridation peut être préparé à l’avance et stocké en aliquotes à -20 °C13.</li>
	<li>Ajouter 200 à 500 μL de tampon d’hybridation à chaque section d’hydrogel de ~1 mm et s’assurer que la totalité de l’échantillon d’hydrogel est immergée.</li>
	<li>Permettre à la sonde PseaerA de s’hybrider avec les échantillons d’hydrogel en les plaçant dans l’obscurité pendant ~ 18-24 h, à 46 °C, sans secouer.</li>
	<li>Décanter le tampon d’hybridation dans un conteneur de collecte des déchets.</li>
	<li>Rincez les échantillons une fois avec un tampon de lavage stérilisé par filtre (337,5 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) [pH 7,2], 0,01 % de SDS et de H2O purifié et déminéralisé) en ajoutant 1 mL de tampon de lavage dans chacun des tubes de 1,5 mL, puis retirez-le. REMARQUE : Le tampon de lavage peut être préparé à l’avance et stocké à température ambiante (RT).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage frais dans les tubes, puis incuber les échantillons dans l’obscurité pendant 6 h à 48 °C, sans agiter.</li>
</ol>4. Liaison à l’hydrogel et à l’anticorps Psl0096
<ol><li>Retirer stérilement le tampon de lavage à l’aide d’une pipette de 1 ml.</li>
	<li>Rincer les échantillons avec un BSA à 2 % (p/v) dans une solution de PBS en ajoutant et en retirant 1 mL de la solution de BSA à 2 %.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de la solution BSA/PBS à 2 % aux échantillons d’hydrogel pour bloquer la liaison aux protéines non spécifiques. Ensuite, incubez les échantillons pendant la nuit, dans l’obscurité, à RT, sans secouer.</li>
	<li>Retirer stérilement la solution bloquante à l’aide d’une pipette de 1 ml.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps Psl0096-Texas Red en diluant l’anticorps à une concentration finale de 0,112 μg/mL dans 500 μL de BSA/PBS frais à 2 %.</li>
	<li>Ajouter la solution d’anticorps à 500 μL aux échantillons d’hydrogel et les incuber à RT pendant 6 h, à l’abri de la lumière, sans agitation.</li>
</ol>5. Coloration DAPI (4′,6′-diamidino-2-phénylindole)
<ol><li>Préparer la solution d’adaptation de l’indice de réfraction (RIMS) en ajoutant 40 g de milieu à gradient de densité non ionique, 30 μL de Tween20, 3 μg d’azoture de sodium et 30 mL de PBS dans une fiole contenant une barre d’agitation magnétique. Remuez la solution pendant 15 minutes sur un agitateur magnétique ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.</li>
	<li>Filtrer Stériliser la solution dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre stérile de 0,2 μm. REMARQUE : La solution peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Retirez la solution d’anticorps Psl0096-Texas Red à l’aide d’une pipette stérile de 1 ml.</li>
	<li>Rincez les échantillons d’hydrogel en ajoutant puis en retirant 1 mL de PBS.</li>
	<li>Incuber les échantillons d’hydrogel avec 250 μL de solution RIMS et 10 μg/mL de DAPI à RT en agitant doucement, dans l’obscurité, pendant la nuit.</li>
	<li>Avant l’imagerie confocale, montez les échantillons sur des chambres de perfusion de 0,9 mm ou 1,7 mm et scellez-les avec une lamelle en verre. REMARQUE : Après la FISH et/ou l’immunohistochimie et avant l’immersion dans le RIMS, des colorations fluorescentes de lectine peuvent être appliquées si la visualisation de la muqueuse des expectorations est souhaitée12.</li>
</ol>6. Imagerie
<ol><li>Effectuez une imagerie confocale de microscopie à balayage laser à l’aide de techniques standard à des grossissements de 25x, 40x, 63x ou 100x.</li>
</ol>

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</ol>

L’objectif de ce protocole est de permettre d’avoir un aperçu de l’organisation in situ des cellules de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les échantillons d’expectorations doivent être conservés à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités s’ils ne peuvent pas être fixés immédiatement. Il a été démontré que le nombre de cellules de P. aeruginosa dans les expectorations ne change pas de manière significative s’il est traité à 1 h, 24 h ou 48 h, lorsqu’il est stocké à...

Dans cette étude, des expériences ont été conçues pour visualiser la structure in vivo de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients pédiatriques atteints de fibrose kystique (FK). Les infections à P. aeruginosa deviennent chroniques chez 30 à 40 % de la population pédiatrique atteinte de mucoviscidose ; Une fois que les infections chroniques se sont établies, il est presque impossible de les éliminer1. Les isolats de P. aeruginosa provenant de patients atteints d’une infection précoce sont généralement plus sensibles aux antimicrobiens, par conséquent, ceux-ci sont traités avec des antibiotiques anti-pseudomonaux pour prévenir l’établissement d’une infection chronique2. Malheureusement, tous les isolats de P. aeruginosa ne sont pas efficacement éliminés des poumons après une antibiothérapie. Les mécanismes précis associés à l’échec des antibiotiques n’ont pas été entièrement élucidés. Des études antérieures ont montré que les variations de la densité cellulaire du biofilm, de l’agrégation et de la production de polysaccharides peuvent affecter l’efficacité des antibiotiques3. P. aeruginosa produit trois polysaccharides extracellulaires : Pel, Psl et alginate4. La plupart des souches de P. aeruginosa ont la capacité génétique d’exprimer chacun des exopolysaccharides, bien que souvent un type de polysaccharide soit exprimé principalement5. L’exopolysaccharide alginate est associé à des infections chroniques dans le poumon de la mucoviscidose, ce qui entraîne un phénotype mucoïde 6,7. Les polysaccharides Pel et Psl ont de multiples fonctions, notamment l’aide à la fixation initiale et au maintien de la structure du biofilm, et l’octroi d’une résistance aux antibiotiques8.
Des méthodes visant à visualiser les structures in vivo des tissus ont été développées pour une variété de types d’échantillons 9,10,11. Plus récemment, ils ont été adaptés pour visualiser in vivo les communautés microbiennes dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose12. L’optimisation d’un protocole de nettoyage tissulaire spécifiquement pour l’identification des communautés microbiennes dans les expectorations a été développée par DePas et al., 201612. Le terme MiPACT, qui signifie identification médicaleaprès la t echnique CLARITY Passive, a été inventé pour l’élimination des expectorations de la mucoviscidose11,12. Pour les techniques de nettoyage des tissus, les échantillons sont d’abord fixés, puis rendus transparents tout en laissant leur architecture inhérente intacte pour la coloration et la visualisation microscopique11. La fixation et l’élimination des échantillons d’expectorations de mucoviscidose permettent aux chercheurs de répondre à des questions liées à la structure du biofilm, à la densité cellulaire bactérienne, aux associations polymicrobiennes et aux associations entre les agents pathogènes et les cellules hôtes. L’avantage d’examiner directement les bactéries qui ont été préservées dans les expectorations est qu’elles peuvent être analysées et visualisées dans un contexte spécifique à l’hôte. Bien que la croissance in vitro d’isolats cliniques en laboratoire à des fins d’expérimentation puisse être très instructive, de telles méthodes ne sont pas en mesure de recréer complètement l’environnement pulmonaire de la mucoviscidose, ce qui entraîne un décalage entre les résultats de laboratoire et les résultats pour les patients.
Les méthodes présentées ici peuvent être utilisées pour réparer et éliminer les expectorations afin de visualiser les bactéries, qu’elles proviennent de patients atteints de mucoviscidose ou de patients atteints d’autres infections respiratoires. Le type spécifique de coloration et d’analyse microscopique décrit ici est l’hybridation in situ par fluorescence (FISH), suivie d’une liaison anti-anticorps Psl dans l’hydrogel, et d’une analyse ultérieure par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Après le nettoyage des tissus, d’autres méthodes d’immunohistochimie et de microscopie peuvent également être appliquées.

<table><tbody><tr><td>29:1 acrylamide bisacrylamide, solution à 30 %</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection à 8 chambres Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Chambres de perfusion Coverwell</td><td>Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Détails de la commande : Produit : Oligo d’ADN modifié ; Nom : PseaerA ; Séquence : [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC ; Synthèse : 50 nmol ; Purification : HPLC ; État du navire : Rendement complet (sec)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>Les anticorps Psl0096-Texas red étaient un cadeau aimablement offert par Medimmune et la société doit être contactée pour toute demande de commande.</td></tr><tr><td>VA-044 Durcisseur</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

La détection précoce et l’éradication de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons des patients atteints de fibrose kystique peuvent réduire le risque de développer une infection chronique. Le développement d’infections chroniques à P. aeruginosa est associé à un déclin de la fonction pulmonaire et à une augmentation de la morbidité. Par conséquent, il y a un grand intérêt à élucider les raisons de l’échec de l’éradication de P. aeruginosa par l’antibiothérapie qui se produit chez environ 10 à 40% des patients pédiatriques. L’un des nombreux facteurs qui peuvent influer sur la clairance de l’hôte de P. aeruginosa et la sensibilité aux antibiotiques est les variations de l’organisation spatiale (comme l’agrégation ou la formation de biofilm) et la production de polysaccharides. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à visualiser les caractéristiques in situ de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Une technique d’élimination des tissus a été appliquée aux échantillons d’expectorations après avoir intégré les échantillons dans une matrice d’hydrogel afin de conserver les structures 3D relatives aux cellules hôtes. Après le nettoyage des tissus, des étiquettes fluorescentes et des colorants ont été ajoutés pour permettre la visualisation. L’hybridation in situ par fluorescence a été réalisée pour la visualisation des cellules bactériennes, la liaison d’anticorps anti-Psl marqués par fluorescence pour la visualisation de l’exopolysaccharide et la coloration DAPI à la coloration des cellules hôtes afin d’obtenir des informations structurelles. Ces méthodes ont permis d’obtenir une imagerie à haute résolution de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose par microscopie confocale à balayage laser.

La conception globale de l’expérience est résumée à la figure 1 et à la figure 2. La figure 1 résume les protocoles de traitement et d’élimination des expectorations. Le traitement et l’élimination des expectorations peuvent prendre jusqu’à 17 jours. Cependant, le protocole peut être arrêté et les échantillons peuvent être stockés après la fixation avec la PFA (jour 2) ou après le nettoyage des tissus (jours 5 à 17 selon le temps de...

Ce protocole fournit des méthodes de visualisation des cellules bactériennes et du polysaccharide du locus de synthèse des polysaccharides (Psl) dans les expectorations des patients atteints de fibrose kystique.

Visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Ce protocole est important car il permet de visualiser directement Pseudomonas aeruginosa et l’exopolysaccharide Psl dans les expectorations de mucoviscidose. Cette technique permet de répondre à des questions sur la façon dont l’organisation spatiale de P. aeruginosa, telle que l’agrégation ou les biofilms, affecte la clairance de l’hôte et la sensibilité aux antimicrobiens. Conservez les expectorations dans un gobelet de prélèvement stérile à quatre degrés Celsius pendant un maximum de 24 heures avant la fixation.Lorsque vous êtes prêt à fixer les échantillons, transférez-les dans un tube stérile de 15 millilitres et ajoutez un volume égal de 4 % de PFA, puis incubez les expectorations pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les échantillons en ajoutant cinq millilitres de PBS pour deux millilitres d’expectorations fixes. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et répétez le lavage deux fois de plus.Remettez la pastille en suspension dans deux fois le volume de PBS avec 0,01 % d’azoture de sodium et stockez-la à quatre degrés Celsius. Ajoutez deux millilitres d’une solution d’acrylamide/bisacrylamide à 30 % 29 dans un tube de trois millilitres avec le capuchon retiré à l’intérieur d’un récipient anaérobie scellé, puis ajoutez 0,5 gramme de durcisseur à deux millilitres de PBS dans un tube de trois millilitres. Laissez le capuchon hors du tube et rangez-le dans le récipient anaérobie scellé.Laissez quelques millilitres de PBS stérile dans le tube avec le capuchon retiré à l’intérieur du récipient anaérobie. Dégazez les composants de l’hydrogel dans le récipient scellé avec un pack anaérobie pendant 72 heures. Préparez une solution de 2,5 millilitres d’hydrogel avec une concentration finale de 0,2 % de durcisseur et 4 % d’acrylamide/bisacrylamide dans du PBS dans un tube de 15 millilitres, et mélangez l’hydrogel par inversion, puis filtrez pour stériliser la solution.Coupez les échantillons d’expectorations en deux petites sections à l’aide d’un scalpel, puis placez chaque échantillon dans un puits d’une lame de verre recouverte de huit chambres. Ajoutez 300 microlitres de solution d’hydrogel stérilisé par filtre dans chaque puits contenant des expectorations et placez-le dans un récipient scellé avec un pack anaérobie pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Transférez les échantillons d’expectorations d’hydrogel solidifié dans un tube de culture de 15 millilitres avec cinq millilitres de SDS à 8 % à pH huit, et laissez les échantillons s’éclaircir pendant trois à 14 jours à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les expectorations deviennent transparentes.Utilisez une pince à épiler stérile pour transférer chaque échantillon inclus dans de l’hydrogel dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de PBS pour laver l’hydrogel. Laissez reposer la solution pendant 30 à 60 minutes avant de la transvaser, puis répétez le lavage deux fois de plus. Conservez les échantillons lavés dans du PBS avec de l’azoture de sodium à 0,01 % et un inhibiteur de RNase à quatre degrés Celsius.Retirez les échantillons d’hydrogel de leur solution de stockage et placez-les sur une surface stérile. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez les hydrogels en tranches d’environ un millimètre d’épaisseur et placez les sections dans des tubes de 1,5 millilitre. Préparez un millilitre de tampon d’hybridation dans un tube de 1,5 millilitre, puis ajoutez la sonde Seer A-sonde marquée par fluorescence et mélangez par inversion.Ajoutez 200 à 500 microlitres de tampon d’hybridation à chaque section, en vous assurant que la totalité de l’échantillon d’hydrogel est immergée. Laissez la sonde Seer A s’hybrider avec les échantillons d’hydrogel en les plaçant dans l’obscurité pendant environ 18 à 24 heures à 46 degrés Celsius sans les secouer, puis ajoutez un millilitre de tampon de lavage frais dans les tubes et incubez-les dans l’obscurité pendant six heures à 48 degrés Celsius. Ajoutez 500 microlitres de BSA et de PBS à 2 % aux échantillons d’hydrogel pour bloquer la liaison aux protéines non spécifiques, puis incubez les échantillons pendant la nuit dans l’obscurité.Le lendemain, préparez la solution d’anticorps Psl0096-Texas Red en diluant l’anticorps à une concentration finale de 0,112 microgramme par millilitre dans 500 microlitres de BSA frais à 2 % dans du PBS. Ajoutez la solution d’anticorps aux échantillons d’hydrogel et incubez-les dans l’obscurité pendant six heures. Ensuite, colorez les échantillons d’hydrogel avec du DAPI en les incubant avec 250 microlitres de solution RIMs et 10 microgrammes par millilitre de DAPI pendant la nuit dans l’obscurité avec une légère agitation.Après la coloration, montez les échantillons sur des chambres de perfusion de 0,9 ou 1,7 millimètre et scellez-les avec une lamelle en verre. Effectuez une microscopie confocale à balayage laser avec des grossissements de 25, 40, 63 ou 100 fois. Ce protocole a été utilisé pour obtenir des images 3D à haute résolution des cellules de P. aeruginosa et de leur structure NC2 dans les expectorations.Un agrégat de cellules au sein d’un échantillon d’expectoration est montré ici. Les formes individuelles des bâtonnets ont été observées en vert à partir de la liaison spécifique à l’espèce de la sonde Seer A-488 aux cellules de P. aeruginosa. L’anticorps Psl0096-Texas Red montre que l’exopolysaccharide pseudomonal dans les expectorations chevauchait principalement les cellules de P. aeruginosa.Cette méthode a également été utilisée pour la visualisation des cellules pseudomonales dans les expectorations par rapport à d’autres cellules bactériennes et structures hôtes. On a observé qu’un groupe de cellules de P. aeruginosa se phagocytait au sein d’une cellule eucaryote, tandis que d’autres petits groupes de cellules cocciques étaient observés dans les environs. Il a également été démontré que l’anticorps PSL 0096 pouvait se lier au PSL produit par P. Aeruginosa planctonique.Le principal avantage de cette technique est qu’elle met en œuvre une approche de nettoyage des tissus suivie d’une hybridation in situ fluorescente, d’une coloration par anticorps et d’une microscopie confocale. Cela permet aux chercheurs de visualiser et d’utiliser des techniques de traitement d’images pour mesurer quantitativement les différences dans les structures de colonisation de P. aeruginosa dans les expectorations de la mucoviscidose en relation avec les résultats de santé des patients.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Actuelle des tests de diagnostic de sensibilité aux antimicrobiens repose sur la croissance planctonique des isolats en nutriments riches, des conditions aérobies. Ici, nous employons un moyen alternatif d'expectoration artificielle pour étudier la sensibilité aux antimicrobiens des biofilms de Pseudomonas aeruginosa dans des conditions aérobies et microaérophiles plus représentatives de la fibrose pulmonaire kystique.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

Source : Beaudoin, T., et al. Visualisation des effets des crachats sur le développement du biofilm à l’aide d’un modèle de verre de couverture à chambre. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une méthode in vitro pour évaluer comment la mucoviscidose dérivée du patient influence la formation de biofilms bactériens. Grâce à des lames de chambre, à la coloration fluorescente et à la microscopie confocale, elle révèle une épaisseur accrue, une architecture modifiée et une biomasse viable plus...

Imagerie confocale des biofilms bactériens induits par des filtrats de crachats chez des patients atteints de mucoviscidose kystique

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

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Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

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P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Ce flux de travail peut être utilisé pour effectuer des tests de sensibilité aux antibiotiques à l’aide d’un modèle ex vivo établi de biofilm bactérien dans les poumons des personnes atteintes de fibrose kystique. L’utilisation de ce modèle pourrait améliorer la validité clinique des essais MBEC (concentration minimale d’éradication du biofilm).

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Découvrez la visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique. Cette méthode permet d'étudier l'organisation spatiale des biofilms et leur impact sur la susceptibilité aux antimicrobiens.

Visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique

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