Name: Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Découvrez une méthode sans OGM pour générer des cellules neuronales à partir de cellules sanguines périphériques reprogrammées. Cette technique utilise la signalisation membrane-noyau et offre des avantages cliniques sécurisés pour la médecine régénérative.

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Dédié à la mémoire du Dr Rainer Saffrich.
Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à José Manuel García-Verdugo et Vicente Herranz-Pérez d’avoir effectué des expériences et des analyses em au Laboratoire de neurobiologie comparative, Institut de biodiversité et de biologie évolutive de Cavanilles, Université de Valence, CIBERNED, Valence, Espagne, qui a été soutenu par un financement de recherche de la subvention Prometeo pour les groupes de recherche d’excellence PROMETEO/2019/075. Le reste de ces travaux a été soutenu par ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Allemagne.

Des approbations éthiques ont été obtenues lors de la réalisation des expériences.
1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMNCs)
<ol><li>S’assurer que tous les donneurs ont signé un consentement éclairé avant le prélèvement sanguin conformément aux lignes directrices de l’établissement.</li>
	<li>Prendre 30 ml de sang de donneurs sains par un personnel médical qualifié selon le protocole standard.</li>
	<li>Isolez les PBMNCs par support de gradient de densité. Utiliser 10 mL de milieux avec 25 mL de sang 1:1 dilué avec une solution saline tampon phosphate (PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 30 min.</li>
	<li>Isoler la couche interphase entre le plasma et le gradient de densité par pipetage. Laver les cellules isolées avec 5 mL de PBS stérile et centrifuger à 300 x g pendant 10 min. Répéter deux fois.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules par des méthodes standard à l’aide d’une chambre de comptage.</li>
</ol>2. Activation de la glycoprotéine humaine ancrée dans le GPI par réticulation d’anticorps à la surface des PBMNCs
<ol><li>Placer les cellules mononucléaires (MNCs) de 6 x10 6 dans des tubes de 15 mL et effectuer la réticulation des anticorps en incubant les cellules avec de l’anticorps spécifique à la protéine membranaire lié au GPI humain (30 μg/mL) pendant 30 min dans du PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) à 37 °C.</li>
	<li>Remplacer le milieu d’incubation par le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove complété par 10 % de sérum fœtal bovin (SBF).</li>
	<li>Cultiver les cellules dans des tubes de polystyrène de 15 mL, mettre les tubes dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant 8-10 jours (sans secouer). Sur D5, ajoutez 1 à 2 mL supplémentaires de milieu d’Iscove complété par 10 % de FBS à chaque tube de 15 mL.</li>
</ol>3. Tri des cellules dédifférenciées nouvellement générées
<ol><li>Comptez les cellules avec un compteur cellulaire automatisé (suspension cellulaire de 18 μL + colorant de fluorescence de 2 μL) ou dans une chambre de comptage.</li>
	<li>Suspension cellulaire cultivée en centrifugeuse (5-7 x10 6)à 300 x g pendant 10 min et aspirer le surnageant résultant avec une pipette Pasteur stérile.</li>
	<li>Re-suspendre la pastille cellulaire dans 90 μL de PBS pré-refroidi pH 7,2, 0,5% BSA et 2 mM EDTA.</li>
	<li>Ajouter des billes magnétiques cd45 positives de taille nanométrique (80 μL) à la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 15 min.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 2 mL de tampon PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Suspendre à nouveau les cellules dans 500 μL de tampon PBS.</li>
	<li>Laver la colonne avec 500 μL de tampon PBS pré-refroidi et la placer dans le champ magnétique.</li>
	<li>Placez la suspension cellulaire sur la colonne et lavez-la avec 500 μL de tampon PBS (deux fois) et le flux de centrifugeuse contenant des cellules CD45 négatives. Collectez-les dans le support d’Iscove complété par 1% BSA.</li>
	<li>Comptez les cellules dans la chambre de comptage.</li>
</ol>4. Préparation de plats de culture cellulaire pour la différenciation neuronale des cellules souches nouvellement générées
<ol><li>Enrober les vaisseaux de culture de poly-L-ornithine et de laminine pour la croissance des cellules neuronales.</li>
	<li>Placer les lamelles de verre dans des plaques à 4 puits et les recouvrir de poly-L-ornithine diluée à 1:5 (0,1 mg/mL dans duddH2O)dans du ddH2O.Placer les lamelles dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h. Puis laver avecddH2O.</li>
	<li>Décongeler lentement la laminine (0,5-2,0 mg/mL) et ajouter au sommet des lamaux de couverture. Incuber à 37 °C pendant 2 h.</li>
	<li>Préparer le milieu d’induction neuronale N2 composé de 49 mL de D-MEM/F12, de 500 μL de supplément de N2, de 400 μL d’acides aminés non essentiels (NEAA), de solution de FGF de base à une concentration finale de 20 ng/mL (préparée à partir d’une solution mère de 100 μg/mL) et d’héparine à une concentration finale de 2 ng/mL.</li>
	<li>Éliminer l’excès de laminine par pipetage et ajouter le milieu neuronal N2 aux plats de culture.</li>
</ol>5. Culture de cellules sanguines dédifférenciées neuronales
<ol><li>Culture de cellules CD45 négatives dérivées de BD sur des lamives de verre recouvertes de laminine/ornithine pendant 2 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2 dans le milieu N2 pour initier une différenciation neuronale des cellules nouvellement générées par BD.</li>
	<li>Cellules de culture supplémentaires dans un milieu de différenciation neuronale composé de 48 mL de milieu neurobasal, 500 μL de L-glutamine, 1 mL de supplément de B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de facteur neurotrophique (GDNF) humain recombinant dérivé de glial (GDNF) à 5 μg/250 μL dans PBS/0,1% BSA, et 50 μL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau humain recombinant (BDNF) à 5 μg/200 μL dans PBS/0,1% BSA et 50 μL de solution d’acide ascorbique 2,9 g/50 mL dans PBS. Placer les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
</ol>6. Analyse par microscopie à immunofluorescence de cellules neurales dérivées du sang
<ol><li>Culturez les cellules comme décrit ci-dessus pendant 16 jours et retirez le milieu.<ol>
<li>Incuber avec un fixateur préchauffé composé de 75 mL d’eau stérile, 4 g de paraformaldéhyde. Ajouter 10 N NaOH au besoin et remuer jusqu’à ce que la solution se dégage. Ajouter ensuite 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL deMgCl2, 2 mL d’EGTA 0,5 M et 4 g de saccharose. Titrer à pH 7,4 avec 6 N HCl, et porter à 100 mL d’eau stérile pendant 15 min, selon Marchenko et al.7.</li>
		<li>Jetez le fixateur et lavez les cellules 3 fois pendant 5 min à chaque fois. Ajoutez immédiatement une solution X de Triton à 0,3% fraîchement faite et perméabilisez les cellules pendant 5 min. Laver 3 fois avec du PBS et ajouter une solution de blocage faite par PBS et BSA à 5%.</li>
		<li>Bloquer les cellules à température ambiante sur une plaque à bascule pendant 1 heure.</li>
		<li>Préparer une dilution appropriée des anticorps dans 1 % de BSA/PBS et incuber les cellules avec des dilutions d’anticorps sur la plaque bascule pendant 1,5 h à température ambiante. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacune, incuber les cellules avec du DAPI et montez les lamures avec un support de montage pour la visualisation au microscope. REMARQUE : Les anticorps directement marqués utilisés dans cette expérience sont énumérés dans la table des matériaux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analyse par microscopie électronique à transmission de cellules nouvellement générées
<ol><li>Ensemencez les cellules pour TEM dans des lames de chambre à 8 puits.</li>
	<li>Fixer les cellules dans du glutaraldéhyde à 3,5 % pendant 1 h à 37 °C, post-fixer dans 2 %OsO4 pendant une heure supplémentaire à température ambiante et colorer dans 2 % d’acétate d’uranyle dans l’obscurité à 4 °C pendant 2 h 30 min.</li>
	<li>Enfin, rincez les cellules dans de l’eau distillée, déshydratez-les dans de l’éthanol et incorporez-les dans de la résine époxy pendant la nuit. Le lendemain, transférer les échantillons dans une étuve à 70 °C pendant 72 h pour le durcissement de la résine.</li>
	<li>Détachez les cultures cellulaires incorporées de la lame de chambre et de la colle vers des blocs d’araldite.</li>
	<li>Couper des sections semi-minces en série (1,5 μm) avec une machine, les monter sur des lames de verre et colorer légèrement avec 1% de bleu de toluidine.</li>
	<li>Collez les sections semi-minces sélectionnées en blocs d’araldite et détachez-les de la lame de verre par congélation répétée (dans de l’azote liquide) et décongélation.</li>
	<li>Préparer des sections ultramin inthes (0,06-0,08 μm) avec une machine et contraster davantage avec le citrate de plomb.</li>
	<li>Obtenez des micrographies à l’aide d’un microscope à balayage électronique avec appareil photo numérique.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

L’auteure correspondante déclare qu’elle est titulaire d’un brevet lié à Novel Human GPI-linked Protein et qu’elle a cofondé et travaille pour ACA CELL Biotech. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

La méthode non-GM de reprogrammation des cellules humaines décrite dans ce travail est basée sur l’activation de membrane à noyau de la ou des machines de signalisation derrière la glycoprotéine de membrane humaine liée au GPI qui initie le processus de dédifférenciatation menant à la génération ex vivo et à l’expansion de PSCs autorenouvants obtenus à partir de sang périphérique humain non manipulé. Ces cellules, lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux appropriés, sont capables de se re-différencier en cel...

Le développement de méthodes de recherche fondamentale et préclinique sur les cellules souches encourage l’application clinique de thérapies à base de cellules souches pour les maladies neurologiques. Une telle thérapie potentielle dépend de manière critique de la méthode de génération de cellules neurales humaines conduisant à la récupération fonctionnelle1.
Les cellules souches neurales (CNS) s’auto-renouvellent et se différencient en nouveaux neurones tout au long de la vie dans un processus appelé neurogenèse adulte. Seules les zones cérébrales très restreintes abritent des NSC compétents pour générer des neurones nouveau-nés à l’âge adulte. Ces NSCs peuvent donner naissance à des neurones matures, qui sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire, remplaçant ainsi les neurones perdus ou endommagés. Malheureusement, ces NSC sont présents en quantités restreintes et cette neurogenèse limitée diminue rapidement au cours du développement juvénile2. Par conséquent, d’autres sources de cellules neurales doivent être considérées dans un objectif de thérapie cellulaire.
Les maladies neurologiques dégénératives sont difficiles à guérir en utilisant des approches pharmacologiques standard. De nouvelles stratégies thérapeutiques pour embrasser de nombreux troubles neurologiques immédicables sont basées sur des thérapies de remplacement cellulaire de tissus malades et blessés. La transplantation de NSC pourrait remplacer les cellules endommagées et fournir des bienfaits. D’autres sources de remplacement des cellules neurales comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (ESC), qui sont dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes mammifères3, ainsi que les cspi4, qui ont une grande capacité d’auto-renouvellement comme les CSE et sont capables de se différencier en diverses lignées cellulaires. Les NSC peuvent également être générés par reprogrammation directe à partir de fibroblastes humains évitant l’état pluripotent5.
La thérapie de remplacement cellulaire est toujours un problème difficile. Bien que l’ESC, le fœtus ou l’iPS puissent être une source de génération de cellules neuronales pour traiter de nombreuses maladies neurologiques incurables, le remplacement autologue des cellules de SC adultes des tissus endommagés est une meilleure alternative qui contourne les préoccupations immunologiques, éthiques et de sécurité.
L’activation de la protéine humaine liée au GPI par réticulation d’anticorps via la phosphorylation de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN déclenche une dédifférenciatation des cellules progénitrices sanguines et la génération de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs)6. Ces cellules différencient in vitro vers les cellules neuronales comme confirmé au moyen de brightfield, d’immunofluorescence et d’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).
Dans ce travail nous décrivons la génération GM-libre de BD-PSCs et leur re-différenciation réussie en cellules avec le phénotype neuronal.

<table><tbody><tr><td>Albumine Fraction V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Cy3 conjugué</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité cellulaire AO/PI</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym discontinué. Le produit fabriqué par Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Acide ascorbique 2-phosphate sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Sans sérum 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Solution de base FGF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td><td>média à gradient de densité</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7,5 %</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>Nano-size magnetic beads</td></tr><tr><td>Lames de comptage de cellules Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym discontinué. Le produit fabriqué par Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Lames de chambre Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>résine époxy</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Discontinué. Disponible sous : TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF recombinant humain</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-glutamine</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodique cellule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Humain BDNF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Laminin souris</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Citrate</td><td>de plomb Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Compteur de cellules automatisé</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym discontinué. Le produit fabriqué par Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Tampon MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml ; ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Morada appareil photo numérique</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplément 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS stérile</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

génération sans ogm de cellules neuronales dérivées du sang

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

De nombreux troubles neurologiques humains sont causés par la dégénérescence des neurones et des cellules gliales dans le cerveau. En raison des limites des stratégies pharmacologiques et autres stratégies thérapeutiques, il n’y a actuellement aucun remède disponible pour le cerveau blessé ou malade. Le remplacement cellulaire apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour des conditions neurodegenerative. À ce jour, des cellules souches neurales (CSCN) ont été générées avec succès à partir de tissus fœtaux, de cellules embryonnaires humaines (SE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Un processus de dédifférenciatation a été initié par l’activation de la glycoprotéine GPI-liée humaine nouvelle, qui mène à la génération des cellules souches pluripotentes. Ces cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs) différencient in vitro en cellules avec un phénotype neural comme montré par brightfield et microscopie d’immunofluorescence. L’analyse d’ultrastructure de ces cellules au moyen de la microscopie électronique confirme leur structure primitive aussi bien que neuronal-comme la morphologie et les caractéristiques subcellulaires.

Les résultats fournissent la preuve que cette nouvelle méthode sans OGM est capable de rétablir les cellules progénitrices du sang à leur état le plus primitif sans agir directement sur le génome humain.
Nous avons précédemment montré que la réticulation des anticorps spécifiques aux protéines liées au GPI initie via la régulation à la hausse PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN de gènes hautement conservés pertinents pour le développement tels que WNT, NOTCH et C-Kit, initiant ainsi un processus ...

Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.

Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

L’importance du protocole repose sur la signalisation membrane à noyau et n’affecte pas directement le génome, comme c’est le cas avec les cellules souches pluripotentes induites. La nature non tératogène des cellules souches pluripotentes dérivées du sang est le principal avantage de la technique, ce qui la rend adaptée à une application clinique sûre dans divers domaines de la médecine régénérative. La Dre Anne-Kathrin Schott, chef de projet, et Oksana Greenacre, assistante de laboratoire dans mon laboratoire, démontrent la procédure.Pour isoler les PBMNCs, ajouter 25 millilitres de sang un-à-un dilué avec du PBS à 10 millilitres de milieu de gradient de densité et centrifuger le mélange à 300 fois G pendant 30 minutes. Isolez la couche d’interface entre le plasma et le gradient de densité par pipetage. Laver les cellules isolées avec cinq millilitres de PBS stérile et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes.Après avoir répété la procédure deux fois, comptez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Ajouter 6 par 10 aux 6èmes cellules mononucléaires à un tube de 15 millilitres, puis effectuer la réticulation des anticorps en ajoutant de l’anticorps spécifique

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Une méthode simple et fiable sur l'isolement et la culture des cellules souches neurales à partir des tissus humains jetés corticale du foetus est décrite. Cultures dérivées de humain connu des troubles neurologiques peuvent être utilisés pour la caractérisation des processus cellulaires et pathologiques moléculaires, ainsi que de fournir une plateforme pour évaluer l'efficacité pharmacologique.

Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

Cette méthode décrit comment isoler et d'immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l'homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l'ensemencement et l'immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des cellules neuronales à partir de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs). Les BD-PSCs sont obtenues en reprogrammant les cellules progénitrices du sang. Les BD-PSC indifférenciées sont cultivées sur des lamelles recouvertes de substrat de culture cellulaire à l’aide d’un milieu d’induction neurale et d’un milieu de différenciation neurale, déclenchant la différenciation en cellules avec un phénotype neuronal.

Génération de cellules neuronales à partir de cellules souches pluripotentes dérivées du sang

La vidéo démontre la génération de neurones à partir de fibroblastes dermiques humains adultes (aHDF). Les aHDF sont reprogrammés à l’aide d’un vecteur lentiviral portant des gènes pour les facteurs de transcription neuronales et les ARN en épingle à cheveux courts (shRNA). Les shRNA inhibent l’expression d’un répresseur transcriptionnel neuronal, et les facteurs de transcription neuronales activent les gènes pour différencier les aHDF en neurones. Ces aHDF reprogrammés sont cultivés dans un...

Génération de neurones en reprogrammant des cellules de fibroblastes dermiques humains

Source : Becker-Kojić, Z. A., et. al., Génération sans GM de cellules neuronales dérivées du sang. J. Vis. Exp. (2021)La vidéo présente un protocole de préparation de cellules neurales dérivées de cellules sanguines périphériques reprogrammées pour la microscopie à fluorescence, mettant en évidence des types de cellules distincts et des stades de développement grâce à l’imagerie par immunofluorescence.

Microscopie par immunofluorescence de cellules neurales différenciées de cellules dérivées du sang périphérique 

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Reprogrammation neuronale directe génère des neurones qui maintiennent l’âge de la cellule somatique départ. Nous décrivons ici une méthode basée sur un vecteur unique pour générer des neurones induites de fibroblastes dermiques provenant de donneurs humains adultes.

Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

Le protocole présente la reprogrammation des cellules mononucléaires périphériques de sang pour induire des cellules souches neurales par l'infection de virus de Sendai, différenciation des iNSCs dans les neurones dopaminergiques, transplantation des précurseurs de DA dans le unilatéralement-lesioned Modèles de souris de la maladie de Parkinson, et évaluation de l'innocuité et de l'efficacité des précurseurs d'AD dérivés de l'iNSC pour le traitement de la MALADIE.

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

Cet article décrit un protocole pour la génération de neurones induits par l’homme dérivés de cellules souches pluripotentes dans un bioréacteur de suspension 3D de paillasse.

Production de neurones 2-inductibles de neurogénine humaine dans un bioréacteur en suspension tridimensionnel

Cette étude définit une nouvelle approche pour l’établissement de cellules microgliales (iMG) dérivées de monocytes humains qui permettent l’évaluation indirecte de l’inflammation cérébrale. Il s’agit d’un modèle cellulaire qui pourrait être bénéfique pour la recherche axée sur l’inflammation potentielle du cerveau et les troubles neuropsychiatriques associés.

Ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour la recherche sur le cerveau à traduction inverse

Découvrez une méthode sans OGM pour générer des cellules neuronales à partir de cellules sanguines périphériques reprogrammées. Cette technique utilise la signalisation membrane-noyau et offre des avantages cliniques sécurisés pour la médecine régénérative.

Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

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