Exploration de la structure des tissus adipeux par compensation du méthylsalicylate et imagerie 3D

Ces protocoles permettent l’analyse de la structure tridimensionnelle de très grand humain sur la souris adipeux tissu ballet microscopie. Faciliter le lien entre le dysfonctionnement pathologique et les changements structurels des tissus adipeux. Ce processus de compensation est très simple, très bien adapté pour éliminer l’homme sur les souris chaudes tissus adipeux et utiliser des solvants moins toxiques tels que l’éthanol ou le salicylate méthylique par rapport à d’autres protocoles clairs.

Commencez par immerger la souris récoltée ou le tissu adipeux blanc humain dans au moins 10 millilitres de formaldéhyde de 4% de puissance dans PBS dans un tube en plastique de 15 millilitres de préférence sous un capot chimique. Secouez le tissu sur une plaque roulante à température ambiante pendant une heure avant de transférer le tube dans une plaque roulante à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin rincer le tissu adipeux blanc fixe dans 10 millilitres de PBS pendant cinq minutes à température ambiante pour enlever toutes les traces de fixatif et transférer le tissu à un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 0,3% glycine dans PBS pour une incubation d’une heure à température ambiante sur un shaker orbital à 100 révolutions par minute.

Lorsque les autres groupes d’aldéhyde libre ont été trempés, immerger le tissu dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 0,2%Triton X-100 dans PBS pour une incubation de deux heures avec secousses à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation traiter le tissu avec 10 millilitres de 0,2%Triton X-100 et 20%DMSO avec secouant à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, immerger le tissu dans un tube en plastique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% désoxycholate et 20%DMSO en PBS pour une incubation d’au moins 24 heures à 37 degrés Celsius avec secousses.

À la fin de l’incubation, rincer le tissu avec 10 millilitres de 0,2%Triton X-100 en PBS sur un shaker orbital à 100 révolutions par minute pendant une heure. Suivi d’une immersion de 15 millilitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant 12 heures à 37 degrés Celsius avec secousses. Pour la coloration du tissu adipeux blanc.

Transférer le tissu en 300 microlitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS, complétés par les principaux anticorps d’intérêt dans un micro tube de 1,5 millilitre le protéger de la lumière avec du papier d’aluminium et placer le tube dans un tube Falcon de 50 millilitres. Placez le tube dans le shaker orbital pendant une incubation de deux jours à 37 degrés Celsius avec des secousses. À la fin de l’incubation rincer le tissu deux fois en 10 millilitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant cinq heures à 37 degrés Celsius avec secousses et protection contre la lumière.

Après le deuxième rinçage laver les tissus en 10 millilitres de frais 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA et PBS pendant 16 à 48 heures à 37 degrés Celsius avec secousse, puis transférer le tissu à un tube de 1,5 millilitre contenant 300 microlitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA dans PBS, complétée par les anticorps secondaires appropriés et protéger le tube de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Après une incubation de deux jours à 37 degrés Celsius sur un shaker, laver le tissu deux fois en 10 millilitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant cinq heures à 37 degrés Celsius avec secousses protégées de la lumière. Après le deuxième lavage, rincer le tissu dans un tube contenant 10 millilitres de frais 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant 16 à 48 heures à 37 degrés Celsius avec secousses et protection contre la lumière.

Suivi d’un lavage de deux heures dans 10 millilitres de PBS seul à 37 degrés Celsius avec secousses et protection contre la lumière. Pour le nettoyage des tissus adipeux blancs à la fin du lavage PBS immerger le tissu et 10 millilitres d’une série ascendante de concentration d’éthanol d’envoi pour une incubation de deux heures par concentration à température ambiante avec des secousses protégées de la lumière comme indiqué. Le lendemain matin, plongez le tissu dans une bouteille en verre de 20 millilitres avec un bouchon en plastique contenant cinq millilitres de salicylate méthyle dans une hotte de fumée.

Le tissu adipeux blanc est encore clairement visible à ce stade. Secouez le récipient pour le protéger de la lumière à température ambiante pendant au moins deux heures. Le tissu adipeux blanc devient complètement transplanté.

Pour l’imagerie confocale 3D du tissu adipeux blanc taché et déblayé monter une chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond de verre et dans une hotte de fumée transférer le tissu à la chambre. Remplissez la chambre de salicylate méthylique frais. Finaliser le montage de la chambre en ajoutant un petit glissement de couverture pour stabiliser le tissu et un grand glissement de couverture pour fermer la chambre.

Placez la chambre sur un stade de microscope confocal inversé pour l’imagerie tissulaire à faible grossissement pour générer quelques cartes 3D centimètre cube de l’échantillon de tissu adipeux entier. Après la génération de cartes 3D, utilisez un objectif aérien interurbain de 20 X qui fournit un bon rapport entre la résolution et la profondeur pour sélectionner plusieurs zones pour l’échantillonnage des tissus à un grossissement plus élevé. Pour la segmentation cellulaire convertir les piles 3D sur le format logiciel pour libérer de l’espace mémoire.

Avant d’ouvrir le module cellulaire du logiciel. Modifiez le réglage de détection cellulaire en colorant la membrane plasmatique et sélectionnez le canal fluorescent du marqueur utilisé pour délimifier la périphérie cellulaire. Ensuite, définissez les seuils, fournissez une plage des tailles de cellules attendues et exécutez la segmentation.

Les effets de la compensation sur le tissu adipeux blanc humain et de souris peuvent être observés à l’œil nu. La compensation améliore également considérablement la profondeur d’image du tissu qui est capable d’être acquise. Et facilite l’imagerie 3D des tissus entiers et la génération de cartes 3D à partir du grossissement 4X.

La cartographie 3D permet en outre d’acquérir la sélection de différentes zones d’intérêt à un grossissement 20X à une profondeur de deux millimètres. La coloration spécifique des gouttelettes lipidiques et des adipocytes peut être obtenue en utilisant respectivement des anticorps perilipins et anti-GLUT4. Les vaisseaux sanguins peuvent être détectés à l’aide d’anticorps CD31 ou d’injection intraveineuse de Lectin DyLight 649 peu de temps avant le sacrifice.

Les macrophages et les lymphocytes T peuvent être visualisés à l’aide d’anticorps anti CD301 phycoerythrine et d’anticorps bleu bêta-Pacifique anti TCR. Le réseau nerveux périphérique peut être détecté à l’aide de l’anticorps anti tyrosine Hydroxylase. À l’aide de ces étiquetages, la taille moyenne et la répartition de la taille des adipocytes et la densité du réseau des vaisseaux sanguins dans le tissu adipeux peuvent ensuite être déterminées.

Il est crucial de suivre le temps d’occupation tel que démontré parce qu’une mauvaise préparation de l’échantillon n’entraînera pas une bonne qualité d’image. Ce protocole peut être combiné avec un système d’imagerie avancé ou peut être couplé à l’analyse d’image post-traitement freeware.