Détection de variantes génétiques dans le gène CALR à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution

Cette méthode définit avec précision les mutations de la calréticuline chez les patients suspectés d’une affection hématologique, en particulier lorsque les autres options diagnostiques sont limitées ou qu’il y a un chevauchement avec des affections non hématologiques. Le principal avantage de la technique du miroir à haute résolution est de détecter les variantes génétiques somatiques courantes dans la région du point chaud du gène de la calréticuline à la limite de détection acceptable et à un coût abordable. Cette technique permet un diagnostic rapide et non invasif des troubles myéloprolifératifs, en particulier la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primitive.

Actuellement, il n’a aucun effet sur le choix du traitement chez ces patients. Cependant, cela pourrait changer à l’avenir. Commencez par préparer le mélange maître de la HRM qPCR comme décrit dans le manuscrit de texte, ce qui en fait suffisamment pour trois réplicats de chaque échantillon d’ADN et de contrôle.

Mélangez le contenu de la réaction en tapotant doucement et en inversant le tube et en tourbillonnant pendant deux à trois secondes, puis faites tourner brièvement le tube pour recueillir les gouttelettes dispersées. Transférez 19 microlitres du mélange maître qPCR HRM dans chaque puits de la plaque de réaction optique à 96 puits. Pipeter un microlitre de témoins négatifs, de témoins positifs et d’échantillons dans les puits appropriés de la plaque pour le contrôle sans matrice ou NTC à un microlitre d’ARN stériles et d’eau libre d’ADN utilisée pour préparer le mélange maître HRM qPCR au lieu de l’ADN.

Fermez fermement la plaque de réaction avec le film adhésif optique pour éviter l’évaporation pendant le cycle. Ensuite, faites-le tourner à 780 fois G à température ambiante pendant une minute. Vérifiez que le liquide se trouve au fond des puits dans la plaque de réaction et exécutez le test.

Attribuez les commandes et les échantillons aux puits appropriés dans le logiciel du système d’instruments et modifiez le protocole d’amplification par défaut de l’instrument. Programmez l’instrument comme décrit dans le manuscrit pour effectuer l’analyse de dissociation immédiatement après la qPCR. À la fin de l’exécution, examinez et vérifiez le tracé d’amplification.

Dans le menu d’expérience du logiciel du système d’instrumentation, sélectionnez l’option de tracé d’amplification. Si aucune donnée n’est affichée, cliquez sur le bouton vert d’analyse. Dans l’onglet Graphique d’amplification du menu déroulant Type de tracé, sélectionnez le tracé qui affiche les données d’amplification sous forme de lectures de fluorescence, normalisées à la fluorescence de la référence passive en fonction du numéro de cycle, Dans le menu déroulant Couleur du tracé, sélectionnez échantillon.

Dans le menu déroulant du type de graphique, sélectionnez le type de graphique d’amplification linéaire, vérifiez que le cycle de début et de fin de la ligne de base est correctement défini. Le cycle de fin doit être réglé quelques cycles avant le numéro de cycle où un signal fluorescent significatif est détecté. Dans le menu déroulant du type de graphique, sélectionnez le type de graphique d’amplification log 10 pour afficher la ligne de seuil sur le graphique en sélectionnant l’option de seuil et ajustez le seuil.

La ligne de seuil doit traverser la phase exponentielle au niveau des courbes qPCR. Vérifiez que tous les puits d’échantillonnage et de contrôle positif ont des courbes d’amplification normales et qu’il n’y a pas d’amplification dans les puits NTC. Un graphique d’amplification normale montre une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35.

Dans les courbes de fusion dérivées, examinez les régions ou les lignes de température avant et après fusion. Les régions pré et post-fusion doivent se trouver dans une zone plate où il n’y a pas de pics ou de pentes importants dans les niveaux fluorescents. Si nécessaire, réglez le début et l’arrêt des lignes de température avant et après la fusion, à environ 0,5 degré Celsius l’une de l’autre.

Redémarrez l’analyse si les paramètres sont ajustés en cliquant sur le bouton d’analyse. Dans l’onglet des paramètres de la parcelle de l’onglet du pot de différence, choisissez l’une des répliques de contrôle de type sauvage comme ADN de référence et relancez l’analyse en cliquant sur le bouton d’analyse. Dans l’onglet Courbes de fusion alignées, vérifiez que tous les témoins positifs ont le génotype correct et que le NTC n’a pas réussi à s’amplifier.

Dans la table des puits, sélectionnez un puits de contrôle pour mettre en évidence la courbe de fusion correspondante dans les graphiques d’analyse et confirmer que la couleur de la ligne correspond au génotype correct. Dans l’onglet Courbes de fusion alignées, examinez attentivement les affichages du tracé pour les échantillons inconnus et comparez-les aux affichages du tracé pour les commandes. Sélectionnez les puits contenant les répétitions d’échantillons inconnues et alignez les courbes de fusion avec les commandes dans une séquence ordonnée en sélectionnant les puits contenant les commandes un par un.

Analysez le résultat de l’échantillon inconnu dans l’onglet Graphique des différences pour vérifier que les résultats obtenus sont cohérents. Sélectionnez les puits contenant les répétitions d’échantillons inconnues et alignez les courbes de fusion avec les commandes dans une séquence ordonnée, en sélectionnant les puits contenant les commandes une par une. Exécutez des produits de GRH qPCR sur un gel préfabriqué d’agarose à 4 % contenant une souche d’acide nucléique fluorescent.

Exécutez un seul NTC négatif positif et un échantillon de réplications qPCR HRM. Retirez le gel préfabriqué et la cassette de l’emballage, puis retirez le peigne et insérez le gel dans l’appareil selon les instructions du fabricant. Diluez un échantillon de 10 microlitres à 20 microlitres avec de l’eau stérile sans ARN ni ADN, et chargez chaque puits avec 20 microlitres de l’échantillon dilué.

Diluez trois microlitres de solution étalon de taille ADN à 20 microlitres et chargez-la dans le puits du marqueur. Remplissez tous les puits vides avec 20 microlitres d’ARN stérile et d’eau libre d’ADN. Sélectionnez immédiatement le programme en fonction du pourcentage de gel utilisé et réglez la durée de fonctionnement de l’appareil sur 20 minutes.

Démarrez l’électrophorèse dans la minute qui suit le chargement des échantillons. Une fois l’électrophorèse terminée, visualisez l’ADN et le gel en utilisant la lumière bleue ou la transillumination UV. Et l’amplification réussie de la région d’intérêt de l’ADN avec une augmentation exponentielle des fluorescents qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 et des valeurs très étroites du cycle de quantification dans toutes les répétitions et les contrôles est une condition préalable à l’identification fiable de la variance génétique par analyse de fusion à haute résolution.

L’analyse HRM est effectuée immédiatement après la qPCR, les régions de fusion actives des échantillons, les contrôles et le NTC sont utilisés pour créer leurs tracés de courbe de fusion alignés. Il est important de définir correctement les régions avant et après la fusion pour visualiser et identifier correctement la variance génétique dans les échantillons. Des courbes de fusion alignées et différents pots sont illustrés ici.

Les échantillons inconnus sont étroitement alignés avec l’un des témoins positifs. Des régions ou des lignes de température avant et après la fusion mal définies entraînent des courbes de fusion alignées et des tracés différents où l’identification correcte de la variance génétique est plus difficile. La variante génétique de l’échantillon peut être identifiée en comparant le profil des bandes de l’échantillon à celui des témoins.

Et en combinant la HRM et l’électrophorèse sur gel d’agarose. L’identification correcte des variantes génétiques ne peut être effectuée que pour les échantillons qui contiennent la même variante génétique que l’un des témoins utilisés dans le test HRM. Les échantillons contenant des variantes génétiques rares de la calréticuline diffèrent par le résultat de la HRM et le motif de la bande d’électrophorèse.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de comparer soigneusement les affichages alignés des courbes de fusion des échantillons connus et des échantillons témoins.