Un essai in vitro d’imagerie à molécule unique pour l’analyse de la cinétique de traduction cap-dépendante

Ce protocole est important car il permet d’utiliser les systèmes de traduction acellulaire existants pour l’analyse d’une seule molécule de traduction eucaryote active. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle préserve les propriétés de traduction en vrac, fournit une résolution de molécule unique et est relativement simple à adapter par rapport à d’autres tests de traduction en vrac. Cette méthode peut être appliquée à tout système de traduction acellulaire dont la traduction dépend de la casquette dans des conditions de masse.

Hongyun Wang, un associé de recherche, et Anthony Gaba, un chercheur scientifique principal du laboratoire Xiaohui Qu, feront la démonstration de la procédure. Au moins trois heures avant d’effectuer une expérience sur une seule molécule, allumez l’incubateur du microscope et réduisez le débit d’air à un faible débit pour éviter une perturbation acoustique excessive de l’expérience. Réglez ensuite la température de l’incubateur à la température optimale spécifique au système de traduction acellulaire.

Au moins une heure avant l’expérience, appuyez sur le bouton d’alimentation du laser situé derrière le boîtier laser, tournez la clé de sécurité du laser et appuyez sur le bouton de démarrage pour allumer le laser. Allumez le microscope et sélectionnez le mode d’imagerie, l’objectif et le jeu de filtres. Allumez la caméra EMCCD, le contrôleur de scène, le pousse-seringue et l’ordinateur, puis ouvrez la caméra, le laser, la platine motorisée et le logiciel de la pompe à seringue.

Dans le logiciel de contrôle laser, cliquez sur connecter pour régler l’intensité laser, décochez le boîtier de l’obturateur et cliquez sur Contrôle pour faire glisser la barre coulissante d’intensité dans la fenêtre contextuelle de contrôle laser. Entrez la profondeur de pénétration pour régler le laser sur l’angle souhaité et vérifiez que le boîtier de l’obturateur est fermé pour maintenir le laser en mode arrêt lorsqu’il n’est pas en image. Lorsque l’appareil photo a refroidi et s’est stabilisé à sa température de fonctionnement désignée, dans le logiciel de l’appareil photo, sélectionnez cinétique pour le mode d’acquisition et entrez les paramètres de temps d’exposition, de longueur de série cinétique et de valeur de gain multiplicateur d’électrons.

Sélectionnez le répertoire et attribuez des noms de fichiers pour l’enregistrement du fichier image de données. Réglez le pousse-seringue à un débit modeste à rapide et ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 70 % dans un tube de microfuge. Insérez l’extrémité du tube du pousse-seringue dans la solution d’éthanol et utilisez le logiciel du pousse-seringue pour basculer le pousse-seringue entre les modes de retrait et de distribution afin de laver le tube trois fois avec de l’éthanol et trois fois avec de l’eau sans RNase.

Après le lavage final à l’eau, tamponnez l’extrémité du tube sur une lingette en tissu propre pour éliminer toute eau résiduelle de l’intérieur du tube et placez l’extrémité du tube dans un tube de microfuge propre. Pour l’immobilisation à trois ARNm biotinylés, placez la chambre d’écoulement dans le porte-échantillon du microscope avec le côté lamelle vers le bas et fixez la chambre avec du ruban adhésif. Utilisez le ruban pour couvrir les entrées et les sorties du canal d’écoulement qui ne sont pas utilisées et ajoutez 1,5 fois le volume d’une solution de streptavidine de 200 microgrammes par millilitre au canal d’écoulement.

Après 10 minutes à température ambiante, lavez et essuyez le canal trois fois avec trois fois le volume de tampon de lavage T50 par lavage et le tissu de laboratoire plié. Après le dernier lavage, placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope et placez le support et la chambre sur la platine du microscope. Approchez ensuite l’objectif de la lamelle jusqu’à ce que l’huile d’immersion sur l’objectif entre en contact avec la lamelle et déplacez l’étage de l’échantillon de sorte que la position du canal d’écoulement soit directement au-dessus de la lentille de l’objectif.

Sur l’écran tactile de la commande du microscope, sélectionnez l’onglet Mise au point et cliquez sur Recherche de mise au point et démarrer. Un bip se fera entendre lorsque le plan de mise au point est atteint avec succès. Dans le logiciel de l’appareil photo, sélectionnez le mode en direct.

Dans le logiciel de contrôle laser, ouvrez l’obturateur laser et réglez le niveau d’intensité du laser. Observez l’image de fluorescence en temps réel en mode en direct et sur l’écran tactile de contrôle du microscope à l’aide de la commande à pas précis pour ajuster la position de l’objectif. Dans le logiciel de la caméra, déplacez la platine pour évaluer le niveau de fond de fluorescence à différentes zones de la surface de détection du canal d’écoulement.

Si la fluorescence est faible, arrêtez le mode en direct et fermez l’obturateur laser dans le logiciel de contrôle laser et remplacez le tampon de lavage du canal d’écoulement par deux fois le volume de la solution d’ARNm biotinylée. Après 15 minutes, lavez le canal trois fois avec trois fois le volume de tampon compatible de traduction par lavage. Pour la détection d’une molécule unique, assemblez trois fois le volume d’un mélange de traduction fraîchement décongelé sans ARNm et complété par une concentration optimisée d’anticorps marqués par fluorescence dans un tube de microcentrifugation sur de la glace et faites tourner brièvement le tube pour recueillir le mélange au fond du tube.

Transférez le mélange de traduction à l’intérieur d’un capuchon de tube de microfuge de 700 microlitres et réglez la pompe à seringue en mode de retrait. Insérez l’extrémité du tube de la pompe dans le mélange de traduction et commencez le retrait de la seringue. Lorsque le mélange de traduction est complètement entré dans la tubulure de la pompe, arrêtez le retrait, inversez les paramètres de la pompe à seringue en mode de distribution et réglez le débit à un débit optimal pour l’administration du mélange de traduction.

Démarrez et arrêtez la seringue pour permettre au mélange de traduction d’atteindre l’extrémité de la tubulure si nécessaire et insérez l’extrémité de la tubulure de la pompe dans l’entrée du canal d’écoulement, en prenant soin d’éviter les bulles. Vissez le support métallique sur mesure sur la plaque porte-échantillon du microscope pour stabiliser la connexion et évaluer la mise au point du microscope et la fluorescence de la zone d’imagerie. Vérifiez que les paramètres d’acquisition vidéo sont corrects et que le nom de fichier et le répertoire appropriés ont été saisis pour l’enregistrement des fichiers.

Déplacez la platine pour permettre l’imagerie d’une zone au centre de la surface de détection du canal d’écoulement. Et sous l’onglet AF continu, cliquez sur les boutons de démarrage. Un bip se fait entendre lorsqu’un plan de mise au point a été atteint avec succès.

Après avoir réduit la lumière ambiante, ouvrez l’obturateur laser et cliquez sur le bouton de prise de signal pour démarrer l’enregistrement. Au bout de cinq secondes, entrez la commande run pour diffuser le mixage de traduction dans le canal de flux. Enregistrez ensuite les données jusqu’à deux heures avec une résolution de 0,5 à deux secondes par image.

Pour analyser les événements de liaison Cy3 ANTI-FLAG, les intensités de fluorescence des taches alpha sélectionnées de Cy3 ont été calculées image par image pour l’ensemble du film et connectées pour former une trajectoire d’intensité. Les trajectoires brutes peuvent sembler bruyantes et peuvent nécessiter d’être affinées à l’aide d’un filtre avant/arrière non linéaire pour réduire le bruit de fond. D’autres améliorations peuvent être obtenues à l’aide d’algorithmes de détection de pas pour numériser les trajectoires.

La liaison des anticorps à un polypeptide naissant provoque une augmentation instantanée de la fluorescence, tandis que la dissociation des polypeptides d’anticorps provoque une diminution instantanée de la fluorescence. L’histogramme du temps de séjour pour l’ARNm de la luciférase s’ajuste à une distribution logarithmique normale et donne un taux de synthèse peptidique de 2,5 plus ou moins 0,1 acides aminés par seconde. L’histogramme de l’heure de première arrivée s’ajuste à une fonction normale logarithmique décalée, illustrant le haut degré d’hétérogénéité de l’activité de traduction d’un seul ARNm.

Comme l’indique l’histogramme, le premier événement de synthèse peptidique sur des molécules d’ARNm à indicateur de luciférase unique peut commencer dès deux minutes et jusqu’à 20 minutes après l’administration du mélange de traduction. Par rapport à la traduction avec l’ARNm de la luciférase, l’histogramme du premier temps d’arrivée avec la traduction de l’ARNm de la luciférase en épingle à cheveux a montré une liaison plus lente des anticorps. Cependant, l’utilisation de mesures de luminescence massive à partir de réactions de traduction acellulaire avec ces mêmes ARNm ne résout pas les différences de cinétique de traduction.

La résolution d’une seule molécule de ce test fournit davantage d’informations cinétiques sur la traduction dépendante de la coiffe qui ne sont pas facilement réalisables avec d’autres approches. La traduction acellulaire eucaryote est sensible aux petites variations et aux conditions expérimentales. Par conséquent, l’attention portée aux détails et à la cohérence est essentielle lors de l’utilisation de ce test pour détecter avec précision les petites différences de traduction.