Name: Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Apprenez la préparation d'échantillons de cristallographie en série avec l'injecteur Lipidico au synchrotron australien. Cette méthode permet de caractériser les cristaux protéiques dans des milieux visqueux tout en minimisant le gaspillage d'échantillon.

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Ces travaux ont été appuyés par l’Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Cette recherche a été entreprise en partie à l’aide de la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO, et a fait usage du détecteur de l’Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Préparation de cristaux dans un média visqueux élevé à l’aide de seringues en verre
<ol><li>Centrifugeuse la solution cristalline doucement (~1.000 x g,~10 min à 22 °C) pour former une pastille en cristal souple et enlever l’excès de tampon. Il en résultera une forte concentration de cristaux dans la pastille qui peut être utilisée pour la collecte de données. REMARQUE : Pour éviter la dilution du média visqueux augmenter la concentration de cristal à cette étape. Optimisez le rapport entre les supports visqueux et le volume cristallin pour chaque échantillon afin d’obtenir une forte concentration de cristaux tout en conservant une viscosité élevée pour les supports. Centrifugeuse la solution cristalline pour former une pastille et enlever l’excès de tampon pour augmenter la concentration de cristal dans la solution, comme décrit dans Darmanin et. al.29.</li>
	<li>Installez deux seringues de 100 μL avec un coupler.</li>
	<li>Attachez le coupler à l’extrémité de la première seringue et ajoutez 28 μL de solution cristalline au sommet de la seringue. Lentement, insérez le piston dans le haut de la seringue et poussez doucement la solution vers le bas à l’extrémité de la pointe du coupler, en enlevant toutes les bulles d’air qui se forment. Faites ceci en suivant l’une des deux méthodes discutées ci-dessous. REMARQUE : Le volume de cristaux à ajouter aux supports visqueux élevés peut être varié s’il ne modifie pas significativement la viscosité de l’échantillon global.<ol>
<li>Première méthode : Utilisez des changements de pression rapides pour faire éclater les bulles d’air.<ol>
<li>Placez soigneusement un doigt ganté sur le dessus du point d’aiguille du coupler émoussé et appliquez (très doucement) une pression pour créer un joint. N’appliquez pas trop de pression car cela peut entraîner une blessure par piqûre d’aiguille.</li>
			<li>Maintenant, tirez le piston en arrière pour tirer la solution loin du point d’aiguille, cela va générer une accumulation de pression dans la seringue.</li>
			<li>Relâchez rapidement la pression en haut de la seringue en enlevant le doigt ganté de la pointe émoussée de l’aiguille. Soyez prudent, si l’échantillon est trop près de la pointe lorsque le doigt est enlevé, il peut pulvériser entraînant la perte d’échantillon. Le changement rapide de pression à l’intérieur de la seringue fera éclater les bulles d’air. Répétez l’année jusqu’à ce que toutes les bulles aient été enlevées.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deuxième méthode : Utiliser la « centrifugeuse humaine » pour éliminer les bulles d’air.<ol>
<li>Placez la seringue dans une main avec l’aiguille orientée vers le haut et le piston coincé entre deux doigts, de sorte qu’il ne peut pas bouger.</li>
			<li>Faites pivoter rapidement le bras en tenant la seringue dans une direction 2 à 3 fois, la force centrifuge résultante sur l’échantillon forcera toutes les bulles d’air hors de la seringue. Soyez prudent, si fait trop lentement échantillon peut être perdu.</li>
			<li>Inspectez la seringue pour déceiller les bulles d’air, si des bulles demeurent, répétez les étapes 1.3.2.1 – 1.3.2.2 jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient enlevées.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>À l’aide d’une spatule fine, ajouter environ 42 μL de graisse de silicone sous vide élevée directement sur le dessus de la deuxième seringue. Poussez le piston jusqu’à la fin, en enlevant toutes les bulles d’air et en veillant à ce qu’il n’y ait pas de trou d’air au bout de la seringue. REMARQUE : La composition précise de la graisse de silicone n’est pas critique car elle agit comme un transporteur inerte. Une valeur de viscosité de >10 Pa.s ou un rapport d’environ 60:40 graisse de silicone à la solution cristalline est optimale pour l’injection, cependant, il est possible que cela puisse varier en fonction des caractéristiques exactes de l’échantillon. Ajustez le volume de solution cristalline ajouté à la graisse de silicone pour optimiser la concentration de cristaux dans le mélange, comme indiqué dans la discussion. Les supports à visqueux autres que la graisse de silicone peuvent être utilisés tant qu’ils sont compatibles avecl’échantillon 30,31,32,33.</li>
	<li>Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’une ou l’autre des deux seringues et attachez les seringues ensemble à l’aide du coupler. Tenez les seringues verticalement en griping juste l’extrémité de la seringue pendant que réchauffer la seringue due à la chaleur produite des doigts peut affecter l’échantillon.</li>
	<li>Mélanger l’échantillon en déprimant doucement le piston du côté de la solution cristalline afin qu’il se mélange à la graisse de silicone, puis pousser le piston sur le côté graisse de silicone, de sorte qu’il pousse l’échantillon vers le côté solution cristalline. Doucement, répétez ce processus 50 à 100 fois afin que l’échantillon soit mélangé à fond et semblehomogène. REMARQUE : Si les cristaux sont cultivés directement dans des supports très visqueux (p. ex., phase cubique lipidique, LCP), les étapes 1.1-1.6 ne sont pas nécessaires. Des protocoles pour la culture des cristaux dans les seringues peuvent être trouvés dans Liu et.al. 34,35. Suivez ce protocole jusqu’à la consolidation de l’échantillon, étape 10, où tout l’échantillon est maintenant contenu dans une seringue et le tampon de cristallisation est supprimé. L’ajout de 7.9MAG n’est pas nécessaire pour ce protocole. Au lieu de cela, retirez tout excès de liquide de la seringue en poussant doucement le piston vers le bas dans l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide dans la seringue.</li>
	<li>Visualisez les cristaux au microscope optique soit à travers la seringue, soit, pour de meilleurs résultats, extrayez une petite quantité (~1 μL) sur une lame de verre et placez un glissement de couverture sur le dessus.</li>
	<li>Vérifiez la concentration de cristaux.<ol>
<li>Déterminez la concentration de cristaux dans la graisse de silicone en comptant le nombre de cristaux dans une zone spécifique à l’aide des images au microscope optique. Pour de meilleurs résultats, une forte densité de cristaux uniformément distribués dans les médias est idéale (>106 cristaux/mL) afin d’obtenir un taux élevé de cristal-frappé.</li>
		<li>Ajustez la concentration de cristaux dans la seringue en modifiant le rapport cristaux/supports visqueux dans les étapes 1.3 et 1.4.<ol>
<li>Pour diminuer la concentration en cristaux, diluer les cristaux dans la seringue en augmentant la quantité de graisse de silicone/HV à l’étape 1.4 ou en diluant la pastille de cristal en solution avec le tampon de cristallisation avant de mettre en place les seringues à l’étape 1.1.</li>
			<li>Pour augmenter la concentration en cristal, diminuer la quantité de graisse de silicone à l’étape 1.4, mais n’oubliez pas de ne pas réduire la viscosité en dessous de 10 Pa.s. REMARQUE : La concentration de cristaux signalée ici a été optimisée pour cet échantillon spécifique et la taille du cristal. Toutefois, la concentration de cristal idéale dépendra de la taille du cristal, de la taille du faisceau, du diamètre interne de l’aiguille (D.I.) et du flux de rayons X incident. Cela peut être déterminé à partir du taux de réussite avec un taux de réussite optimal d’environ 30% considéré comme « bon ». Dans la pratique, la concentration en cristaux doit être optimisée pour différents échantillons pendant le temps de faisceau pour obtenir le taux de frappe désiré. Commencez par une forte concentration de cristaux, 109 cristaux/mL. La procédure d’ajustement de la concentration en cristal est donnée dans Liu et.al. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Le protocole peut être mis en pause ici jusqu’à ce que l’injecteur soit prêt pour la collecte de données.<ol>
<li>Si les cristaux sont cultivés en LCP, scellez-les et laissez-les rester dans des seringues jusqu’à quelques jours à température ambiante.</li>
			<li>Si les cristaux ont été transférés dans un autre média visqueux élevé (p. ex., la graisse de silicone), un test de stabilité des cristaux au fil du temps devrait être effectué avant la mesure. Cela déterminera combien de temps les cristaux sont stables dans le média inerte (idéalement > 8 h) et le délai pour la collecte de données. Ici, les cristaux de lysozyme ont été stables pendant des jours dans la graisse de silicone et n’ont pas montré de signes de dissolution lorsqu’ils ont été inspectés à l’aide d’un microscope optique.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Déplacez tout l’échantillon dans une seringue avant de débrancher le coupler. Déconnecter le coupler de la seringue et fixer l’aiguille d’injection. Vissez fermement l’aiguille dans la base de la seringue et assurez-vous qu’elle est bien attachée pour éviter toute fuite. Une aiguille i.D. de 108 μm (longueur d’aiguille de 13 mm, style point 3) a été utilisée pour cette expérience. Selon la taille du cristal et la taille du faisceau, fixez une aiguille d’I.D. de 51 μm ou de 108 μm. REMARQUE : Le pré-test du flux d’échantillons avant l’heure du faisceau est nécessaire pour être en mesure de sélectionner la taille correcte de l’aiguille injecteur. Selon les caractéristiques de l’échantillon (c.-à-vis de la viscosité, de la charge, de la composition tampon) et de l’i.D. de l’aiguille, les échantillons circuleront différemment. Par conséquent, il est recommandé de tester une variété de tailles d’aiguilles pour produire le flux le plus stable avec la plus petite aiguille d’i.d. possible afin de maximiser le rapport signal-bruit lors de la collecte de données.</li>
	<li>Si l’injecteur est déjà monté et aligné sur la ligne de faisceau, déplacez-vous vers la section 3 et montez la seringue de l’échantillon directement sur l’injecteur. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>2. Montage et contrôle d’injecteur
<ol><li>Montez l’injecteur sur la ligne de faisceau. Retirez la buse cryogénique sur la ligne de faisceau MX2 et remplacez-la par l’injecteur. Desserrez la vis de serrage qui maintient la buse cryogénique et fixez-la au support situé à côté de la scène motorisée.</li>
	<li>Soulevez l’injecteur de son chariot en tenant la poignée noire et placez-la sur la scène motorisée.<ol>
<li>Attacher l’injecteur au stade motorisé; main serrer le bouton de vis à serrant noir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter une seringue vide sur l’injecteur<ol>
<li>Dans l’interface de contrôle informatique injecteur (c.-à-d. le logiciel de contrôle de position EPOS), sélectionnez le mode Homing sous outils dans le menu logiciel. Ensuite, sélectionnez Commutateur limite négative, et Démarrer Homing, laissez le logiciel s’exécuter jusqu’à ce que la vis est rétractée suffisamment pour la seringue pour s’adapter sous la vis. S’il n’est pas surveillé, l’interrupteur limite arrête automatiquement la vis.</li>
		<li>Montez une seringue vide (« factice ») sur l’injecteur en insérant l’aiguille à travers la fente dans le porte-seringue. Alignez la seringue contre le support.</li>
		<li>Attachez la seringue avec deux anneaux O.<ol>
<li>Enroulez le premier anneau O sur la partie médiane de la seringue en l’attachant aux crochets de chaque côté de la seringue.</li>
			<li>Bouclez le deuxième anneau O autour des crochets sur la partie supérieure de la seringue, puis placez une partie de l’anneau O sur le dessus de la seringue en verre comme le montrent la démonstration et la figure 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aligner l’injecteur sur le faisceau de rayons X<ol>
<li>Déplacez l’étape motorisée avec l’injecteur vers le point d’interaction aux rayons X via le logiciel de commande de la ligne de faisceau. Cela peut être visualisé à l’aide de la caméra en ligne. La taille et la position du faisceau sont indiquées par une croix rouge sur l’écran et le stade motorisé peut être déplacé pour aligner l’aiguille avec la région d’interaction aux rayons X.</li>
		<li>Ajustez la position x et y de la scène pour aligner l’aiguille avec la croix rouge.</li>
		<li>Ajustez la position z jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit mise au point.</li>
		<li>Vérifiez visuellement l’alignement de la pointe de l’aiguille et du faisceau de rayons X en vérifiant que la pointe de seringue rencontre le réticule qui sont visibles dans l’image du microscope optique générée par la caméra beamline.</li>
		<li>Une fois que la pointe de l’aiguille est alignée déplacer la pointe au-dessus des poils croisés ~ 100 μm. Cela élimine la dispersion des rayons X de la pointe de l’aiguille. REMARQUE : Le montage et l’alignement de l’injecteur sur la ligne de faisceau MX2 au synchrotron doivent être effectués par les scientifiques de la ligne de faisceau et peuvent être complétés en moins de 30 minutes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montage de la seringue d’échantillon
<ol><li>Remplacer la seringue vide par la seringue de l’échantillon en suivant l’étape 2.3.</li>
	<li>Placez le bouchon d’injecteur sur la tête du piston de seringue de l’échantillon.</li>
	<li>Déplacez la vis d’entraînement vers le haut du bouchon.</li>
	<li>Dans le logiciel de contrôle injecteur sélectionnez le mode Velocity.</li>
	<li>Entrée 3000 rpm (~115 nL/s) comme valeur de réglage et appuyez sur Appliquer la valeur de réglage.</li>
	<li>Lorsque la vis d’entraînement touche le bouchon sur la tête du piston de seringue, arrêtez le moteur.<ol>
<li>Réglez la valeur du régime à zéro dans le logiciel de contrôle de l’injecteur en changeant la valeur de réglage à « 0 » à mesure que la vis s’approche du bouchon.</li>
		<li>Une fois le contact effectué, activez la valeur prédéfinise en appuyant sur Appliquer la valeur de réglage pour arrêter la vis instantanément.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agiter doucement le bouchon pour s’assurer qu’il est fermement maintenu en place. REMARQUE : Chaque fois qu’une nouvelle valeur définie est entrée dans la boîte de valeur de réglage dans le logiciel de contrôle, elle n’est activée qu’après avoir appuyé sur la valeur de réglage d’application.</li>
</ol>4. Exécution de l’injecteur
<ol><li>Une fois que la vis d’entraînement du bouchon a pris contact ferme avec le haut du piston, changez la valeur de réglage du régime à 100. Cela équivaut à ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Inspectez visuellement la pointe de l’aiguille lorsque l’échantillon sort ou regardez l’image de la caméra beamline de l’aiguille pour observer quand l’échantillon commence à extruder de la pointe de l’aiguille.</li>
	<li>Effectuez une fouille du clapier, fermez la porte de la huche et allumez le faisceau de rayons X. À partir de ce point, l’injecteur doit être actionné à distance de l’extérieur du clapier.</li>
	<li>Réglez le régime jusqu’à ce qu’un flux stable soit généré.<ol>
<li>Réduire la valeur de réglage du régime à 90.</li>
		<li>Répétez l’étape 4.4.1, en diminuant la valeur de réglage du régime par incréments de 10, pour ralentir le flux tout en maintenant un flux stable. Pour la graisse de silicone une valeur de 30 rpm a été utilisée. REMARQUE : La plage typique du régime varie entre 30 et 100 rpm (1 à 4 nL/s) selon les caractéristiques de l’échantillon et le temps d’exposition aux rayons X. En général, le régime doit être réglé pour produire le débit le plus lent (afin de minimiser la consommation d’échantillons) tout en maintenant un flux stable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gestion d’un flux d’échantillons qui ne coule pas bien.<ol>
<li>Continuez d’augmenter la valeur de réglage du régime par incréments de 10 jusqu’à ce que le flux soit plus droit. Si le flux ne se stabilise pas, même après avoir augmenté la valeur de réglage du régime à la valeur maximale de 100 rpm, essayez d’améliorer la stabilité en implémentant l’une des deux méthodes décrites ci-dessous.<ol>
<li>Première méthode : Insérez un échantillonneur de polystyrène sous le flux d’échantillons pour aider à guider l’échantillon. Cette méthode fonctionne bien pour les flux d’échantillons hautement chargés.</li>
			<li>Deuxième méthode : Insérez un entonnoir d’aspiration venturi à l’échantillonneur. Pour fournir de l’air à l’entonnoir, connectez-le au tube de sortie d’air situé dans le clapier. Cette méthode peut aider à diriger et stabiliser le flux d’échantillons indépendamment de la charge du flux.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois qu’un flux constant et régulier est atteint, commencez la collecte de données et optimisez la distance du détecteur selon une expérience normale de cristallographie aux rayons X. REMARQUE : Le régime est converti en débit à l’aide de la table de conversion fournie dans l’information supplémentaire, « Calculateur d’appareils Lipidico ». Entrez la valeur du régime, le diamètre des aiguilles et les volumes de seringues pour calculer le débit à l’aide de cette calculatrice.</li>
</ol>

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<li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science%3A+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li>
</ol>

MK travaille pour les designs Kusel. Kusel Design, un développeur d’appareils de laboratoire personnalisé, a été engagé par le Dr Peter Bentsen de l’Université De La Trobe et le Dr Tom Caradoc-Davies de l’ANSTO et de développer un dispositif à faible coût pour permettre des études visqueuses élevées dans la ligne de faisceau MX2 au Synchrotron australien. Le dispositif a été développé en étroite consultation avec le Dr Caradoc-Davies. Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Une alternative HVI a été développée, idéale pour effectuer des expériences SX à des sources synchrotron. Il présente deux avantages clés par rapport aux IDH existants. Tout d’abord, il est facile à installer sur la ligne de faisceau permettant une commutation rapide entre la cristallographie conventionnelle et SX, seulement ~ 30 minutes est nécessaire pour l’installation et l’alignement sur MX2. Deuxièmement, les seringues d’échantillon utilisées pour faire pousser des cristaux peuvent être directement utilisées comme r...

La cristallographie en série (SX) est une technique qui a été développée initialement dans le contexte des lasers à électrons libres à rayons X (XFELs)1,2,3,4. Bien que les approches à cibles fixes puissent être utilisées pour SX5,6,7, généralement, les systèmes d’injection sont utilisés pour livrer des cristaux dans un flux continu au faisceau de rayons X. Parce qu’il combine les données d’un grand nombre de cristaux, SX évite la nécessité d’un alignement de cristal pendant l’expérience, et permet de recueillir des données à températureambiante 8,9. À l’aide d’un injecteur approprié, les cristaux sont diffusés un par un dans la zone d’interaction aux rayons X et les données de diffraction qui en résultent sont recueillies sur un détecteur dezone 9,10. À ce jour, SX a réussi à résoudre un certain nombre de structures protéiques1,11,12,13, y compris les cristaux trop petits pour être mesurer à l’aide de la cristallographie conventionnelle. Il a également fourni de nouvelles perspectives sur la dynamique moléculaire résolue dans le temps en exploitant la durée de l’impulsion femtoseconde du XFEL. En lançant des réactions pompe-sonde avec des sources laser optiques, des études approfondies ont été menées sur le photosystème II14,15, protéine jaune photoactive16,17, cytochrome C oxidase18, ainsi que la bactériorhodopsine19,20,21. Ces études ont sondé la dynamique de transfert d’électrons qui se produit après l’activation de la lumière démontrant le potentiel significatif de la cristallographie en série pour comprendre les processus biologiques résolus dans le temps.
Le développement de la cristallographie en série est également de plus en plus répandu aux sources synchrotron9,12,20,22,23,24. Le SX à base de synchrotron permet de mesurer efficacement un grand nombre de cristaux individuels à température ambiante à l’aide d’un système d’injection approprié. Cette approche convient aux cristaux plus petits, donc, en plus d’exiger un détecteur rapide de taux d’image pour recueillir les données, un faisceau micro-focalisé est également nécessaire. Par rapport à la cristallographie conventionnelle, SX n’implique pas le montage et l’alignement des cristaux individuels dans le faisceau de rayons X. Étant donné que les données d’un grand nombre de cristaux individuels sont fusionnées, la dose de rayonnement reçue par chaque cristal peut être considérablement réduite par rapport à la cristallographie conventionnelle. Synchrotron SX peut également être appliqué à l’étude des réactions résolues dans le temps, même jusqu’au régime milliseconde, à condition qu’un détecteur avec un taux d’image suffisamment élevé est disponible (par exemple, 100 Hz ou plus). Plusieurs expériences de cristallographie en série ont été réalisées au synchrotron à l’aide d’injecteurs initialement développés aux sources XFEL20,22,23. Les deux types les plus communs d’injecteur sont la buse virtuelle dynamique de gaz (GDVN)25 et l’injecteur visqueux élevé (HVI)9,24,26,27,28. Le GDVN est idéal pour injecter de faibles viscosités, des échantillons liquides, mais nécessite des débits élevés pour atteindre des débits stables, ce qui conduit à des taux élevés de consommation d’échantillons. En revanche, les HVI conviennent aux échantillons de viscosité élevée qui permettent la production d’un flux stable à des débits beaucoup plus faibles, ce qui entraîne une consommation d’échantillons beaucoup plus faible. L’injecteur HVI favorise donc la livraison d’échantillons lorsqu’un porteur visqueux est préférable (p. ex., à base de lipides pour les protéines membranaires) et/ou que de grandes quantités d’échantillons ne sont pas disponibles. Les injecteurs SX sont généralement difficiles à utiliser et nécessitent une formation approfondie pour fonctionner. Il s’agit également de protocoles de transfert d’échantillons longs, car l’échantillon doit être chargé dans un réservoir spécialisé, ce qui comporte généralement un risque élevé associé à la perte d’échantillons dans le « volume mort » ou par des fuites dans les connexions. Par conséquent, il est souhaitable d’optimiser la conception de l’injecteur pour atténuer les pertes avant que l’échantillon n’atteigne le faisceau de rayons X.
Récemment, les premiers résultats SX ont été publiés à l’aide de Lipidico23 avec une cible lysozyme, à l’aide d’un détecteur Eiger 16M. Cette conception d’injecteur limite le gaspillage de l’échantillon en minimisant le nombre d’étapes impliquées dans le fait de passer de la cristallisation initiale au transfert de cristaux dans l’injecteur, suivi de la livraison de l’échantillon au faisceau de rayons X. Ce manuscrit décrit et démontre la procédure de transfert de l’échantillon à partir de la préparation de l’échantillon, du passage au processus d’injection, et enfin de la collecte de données, à l’aide du même récipient de cristallisation. Le fonctionnement de l’injecteur est également décrit.

<table><tbody><tr><td>Lysozyme de blanc d’œuf de poule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Utilisé pour faire pousser des cristaux pour tester l’injecteur et les cristaux sont transférés dans de la graisse de silicone. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Graisse de silicone sous vide poussé</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td>Utilisée pour le test de l’injecteur. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Aiguille d’injecteur (108 &micro ; m ID)</td><td>Hamilton</td><td>réf. n° de pièce : 7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Seringues étanches aux gaz en verre, 100 & micro ; l</td><td>Hamilton</td><td>réf. : 7656-01</td><td>Seringues utilisées pour l’injection d’échantillons. www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Coupleur de seringue LCP</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>Coupleur de seringue pour mélanger les échantillons</td></tr><tr><td>Injecteur Lipidico</td><td>La Trobe Univerity/ANSTO Il s’agit d’un</td><td></td><td>équipement spécifique accessible via l’Université La Trobe / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td></tr></tbody></table>

protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Une installation pour effectuer des mesures de cristallographie en série a été développée au synchrotron australien. Cette installation intègre un injecteur visqueux élevé construit à cet effet, Lipidico, dans le cadre de la cristallographie macromoléculaire (MX2) beamline pour mesurer un grand nombre de petits cristaux à température ambiante. L’objectif de cette technique est de permettre aux cristaux d’être cultivés/transférés dans des seringues en verre pour être utilisés directement dans l’injecteur pour la collecte de données de cristallographie en série. Les avantages de cet injecteur comprennent la capacité de réagir rapidement aux changements dans le débit sans interruption du flux. Plusieurs limitations pour cet injecteur de viscosité élevée (HVI) existent qui incluent une restriction sur les viscosités autorisées d’échantillon à >10 Pa.s. La stabilité du flux peut également être un problème en fonction des propriétés spécifiques de l’échantillon. Un protocole détaillé sur la façon de mettre en place des échantillons et d’utiliser l’injecteur pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien est présenté ici. La méthode démontre la préparation de l’échantillon, y compris le transfert de cristaux de lysozyme dans un média visqueux élevé (graisse de silicone), et le fonctionnement de l’injecteur pour la collecte de données à MX2.

Lipidico est un HVI construit comme un système de livraison alternatif pour une utilisation sur MX2 (Figure 1). Il est idéal pour SX où les cristaux sont soit cultivés en phase cubique lipidique ou transférés à un média inerte visqueux élevé.
Pour démontrer l’application injecteur, de la graisse de silicone mélangée à des cristaux de lysozyme a été utilisée pour recueillir des données SX à la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien. Pour monter l’injecteur...

L’objectif de ce protocole est de démontrer comment préparer des échantillons de cristallographie en série pour la collecte de données sur un injecteur visqueux élevé, Lipidico, récemment commandé au synchrotron australien.

Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Ce protocole offre aux scientifiques l’occasion de caractériser des cristaux de protéines intégrés dans des matériaux très visqueux, ainsi que d’autres matériaux mous actuellement difficiles à caractériser à l’aide des configurations existantes. À l’aide de cette méthode, les échantillons sont préparés dans des seringues en verre, montées directement sur l’injecteur, ce qui rend le système d’injection facile à utiliser et minimise le gaspillage d’échantillons. Pour préparer des cristaux à un milieu visqueux élevé, centrifugez d’abord la solution cristalline à basse vitesse pour former une pastille de cristal mou.Après avoir retiré l’excès de fluide, fixez un coupleur à l’extrémité d’une seringue en verre de 100 microlitres et chargez 28 microlitres de la solution cristalline dans le corps de la seringue. Insérez lentement le piston dans le haut de la seringue et poussez doucement la solution jusqu’à l’extrémité de l’embout du coupleur. Pour éliminer les bulles, utilisez un doigt ganté pour appliquer une pression très douce sur le haut de la pointe de l’aiguille du coupleur émoussé pour créer un joint et rétractez le piston pour éloigner la solution de la pointe de l’aiguille afin de créer une accumulation de pression à l’intérieur de la seringue, puis retirez le doigt pour relâcher rapidement la pression et faire éclater les bulles à l’intérieur de la seringue.Vous pouvez également tenir la seringue d’une main, l’aiguille vers le haut et le piston coincé entre deux doigts, et faire pivoter rapidement le bras qui tient la seringue dans une direction deux à trois fois. La force centrifuge qui en résulte forcera les bulles d’air à sortir de la seringue. Lorsque toutes les bulles ont été éliminées, utilisez une spatule fine pour ajouter 42 microlitres de graisse silicone sous vide poussé directement sur le haut d’une deuxième seringue de 100 microlitres et enfoncez le piston jusqu’à la fin pour éliminer toutes les bulles d’air et pour vous assurer qu’il n’y a pas d’espace d’air à l’extrémité de la seringue.Lorsque toutes les bulles ont été retirées des deux seringues, en tenant les deux seringues par les extrémités, fixez les seringues avec le coupleur. Pour mélanger les échantillons, enfoncez doucement et séquentiellement la solution cristalline et les pistons de la seringue de graisse de silicone 50 à 100 fois jusqu’à ce que les matériaux soient bien mélangés et semblent homogènes. Visualisez ensuite les cristaux au microscope optique.Pour déterminer la concentration de cristaux dans la graisse silicone, comptez le nombre de cristaux dans une zone spécifique à l’aide des images du microscope optique. Pour diminuer la concentration de cristaux, répétez la préparation des cristaux en utilisant un volume plus élevé de graisse silicone ou diluez la pastille de cristal dans un tampon de cristallisation avant la configuration de la seringue. Pour augmenter la concentration de cristaux, répétez la préparation des cristaux en utilisant un plus petit volume de graisse silicone, en veillant à ne pas réduire la viscosité en dessous de 10 pascals.Lorsque la concentration cristalline appropriée a été obtenue, déplacer l’échantillon entier dans une seule seringue et remplacer le coupleur par une aiguille d’injection de 108 microns de diamètre intérieur vissée très fermement dans la base de la seringue. Pour configurer l’injecteur, sélectionnez les outils et le mode de guidage et l’interrupteur de fin de course négatif, démarrez le guidage et laissez le logiciel fonctionner jusqu’à ce que la vis soit suffisamment rétractée pour qu’une seringue de 100 microlitres puisse passer sous la vis. Insérez l’aiguille d’une seringue vide dans la fente du porte-seringue pour monter la seringue sur l’injecteur et alignez la seringue contre le support.Enroulez un joint torique sur la section médiane de la seringue, en fixant l’anneau aux crochets de chaque côté de la seringue et enroulez un deuxième joint torique autour des crochets sur la partie supérieure de la seringue. Assurez-vous qu’une partie du deuxième joint torique est positionnée sur le dessus de la seringue en verre. Pour préparer la seringue d’échantillon, amorcez la seringue, placez le capuchon de l’injecteur sur la tête du piston de la seringue d’échantillon et chargez la seringue sur l’injecteur.Déplacez la vis d’entraînement vers le haut du capuchon. Dans le logiciel de contrôle de l’injecteur, sélectionnez le mode de vitesse et activez le mode de vitesse. Réglez la valeur de réglage sur 3 000 tours par minute et cliquez sur Appliquer la valeur de réglage.Lorsque la vis s’approche du capuchon sur la tête du piston de la seringue, mettez la valeur de réglage à zéro. Une fois le contact établi, cliquez sur appliquer la valeur de réglage pour activer la valeur prédéfinie, en arrêtant la vis instantanément. Ensuite, remuez doucement le capuchon pour vous assurer qu’il est fermement maintenu en place.Pour faire fonctionner l’injecteur, modifiez la valeur de réglage à 100 tours par minute et inspectez visuellement la pointe pour observer l’échantillon lorsqu’il commence à extruder. Après avoir fermé le clapier, diminuez la valeur de réglage par tranches de 10 jusqu’à ce qu’un flux de matériau lent mais stable soit observé. Si le flux d’échantillon ne s’écoule pas correctement, augmentez la valeur de réglage par incréments de 10 tours par minute jusqu’à ce que le flux devienne plus droit.Si le flux ne se stabilise pas, insérez un récupérateur d’échantillons en polystyrène sous le flux d’échantillon pour aider à guider l’échantillon. Vous pouvez également insérer un entonnoir d’aspiration Venturi dans le récupérateur d’échantillons, qui peut être connecté au tube de sortie d’air situé dans le clapier du synchrotron australien. Pour déterminer le débit du flux, utilisez le calculateur de débit de l’appareil Lipidico.Déterminer la vitesse de fonctionnement optimale de l’échantillon pour l’injecteur est crucial pour la stabilité du flux. Un débit lent entraîne une expansion de la graisse silicone qui s’échappe de l’injecteur, tandis qu’un débit plus rapide produit un jet plus fin. L’enroulement du flux de milieu visqueux a été régulièrement observé.Pour surmonter ce problème dans les échantillons fortement chargés, un récupérateur de polystyrène peut être utilisé pour introduire une faible force électrostatique. Dans cette analyse, une seringue en verre contenant 26 microlitres de cristaux de lysozyme en suspension dans de la graisse silicone a été utilisée. Une quantité suffisante de données a été collectée en 38 minutes, permettant de générer la carte de densité électronique entourant les liaisons disulfure dans la structure du lysozyme.N’oubliez pas d’utiliser un petit volume d’échantillon sur la lame de verre pour évaluer la concentration cristalline de l’échantillon afin de déterminer si la viscosité doit être corrigée. La polyvalence de l’injecteur permet la caractérisation par rayons X d’autres matériaux très visqueux. Par exemple, des structures de liquide ionique à l’aide de la recherche sur les batteries ou des matériaux colloïdaux à l’aide de produits laitiers.

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Nous décrivons des procédures pour la préparation et l’administration de microcristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la cristallographie en série à l’aide de lasers à rayons X à électrons libres et de sources synchrotron. Ces protocoles peuvent également être appliqués pour l’incorporation et l’administration de microcristaux de protéines solubles, ce qui permet de réduire considérablement la consommation d’échantillons par rapport à l’injection de liquide.

Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

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Un protocole simplifié permettant d’effectuer une caractérisation biochimique et structurelle vaste une protéine de liaison du substrat glucidique de Streptococcus pneumoniae est présenté.

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Le succès d’une expérience de cristallographie femtoseconde série temporelle est tributaire de la livraison d’échantillon efficace. Nous décrivons ici les protocoles afin d’optimiser l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine par un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. La méthodologie s’appuie sur l’homogénéisation des échantillons avec un coupleur de trois voies nouvel et de visualisation avec une caméra à haute vitesse.

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Cette contribution décrit comment configurer la cristallisation des protéines sur des dispositifs cristaux sur cristaux et comment effectuer une collecte automatisée de données série à température ambiante à l’aide de la plate-forme de cristallisation sur puce.

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