Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien

Ce protocole offre aux scientifiques l’occasion de caractériser des cristaux de protéines intégrés dans des matériaux très visqueux, ainsi que d’autres matériaux mous actuellement difficiles à caractériser à l’aide des configurations existantes. À l’aide de cette méthode, les échantillons sont préparés dans des seringues en verre, montées directement sur l’injecteur, ce qui rend le système d’injection facile à utiliser et minimise le gaspillage d’échantillons. Pour préparer des cristaux à un milieu visqueux élevé, centrifugez d’abord la solution cristalline à basse vitesse pour former une pastille de cristal mou.

Après avoir retiré l’excès de fluide, fixez un coupleur à l’extrémité d’une seringue en verre de 100 microlitres et chargez 28 microlitres de la solution cristalline dans le corps de la seringue. Insérez lentement le piston dans le haut de la seringue et poussez doucement la solution jusqu’à l’extrémité de l’embout du coupleur. Pour éliminer les bulles, utilisez un doigt ganté pour appliquer une pression très douce sur le haut de la pointe de l’aiguille du coupleur émoussé pour créer un joint et rétractez le piston pour éloigner la solution de la pointe de l’aiguille afin de créer une accumulation de pression à l’intérieur de la seringue, puis retirez le doigt pour relâcher rapidement la pression et faire éclater les bulles à l’intérieur de la seringue.

Vous pouvez également tenir la seringue d’une main, l’aiguille vers le haut et le piston coincé entre deux doigts, et faire pivoter rapidement le bras qui tient la seringue dans une direction deux à trois fois. La force centrifuge qui en résulte forcera les bulles d’air à sortir de la seringue. Lorsque toutes les bulles ont été éliminées, utilisez une spatule fine pour ajouter 42 microlitres de graisse silicone sous vide poussé directement sur le haut d’une deuxième seringue de 100 microlitres et enfoncez le piston jusqu’à la fin pour éliminer toutes les bulles d’air et pour vous assurer qu’il n’y a pas d’espace d’air à l’extrémité de la seringue.

Lorsque toutes les bulles ont été retirées des deux seringues, en tenant les deux seringues par les extrémités, fixez les seringues avec le coupleur. Pour mélanger les échantillons, enfoncez doucement et séquentiellement la solution cristalline et les pistons de la seringue de graisse de silicone 50 à 100 fois jusqu’à ce que les matériaux soient bien mélangés et semblent homogènes. Visualisez ensuite les cristaux au microscope optique.

Pour déterminer la concentration de cristaux dans la graisse silicone, comptez le nombre de cristaux dans une zone spécifique à l’aide des images du microscope optique. Pour diminuer la concentration de cristaux, répétez la préparation des cristaux en utilisant un volume plus élevé de graisse silicone ou diluez la pastille de cristal dans un tampon de cristallisation avant la configuration de la seringue. Pour augmenter la concentration de cristaux, répétez la préparation des cristaux en utilisant un plus petit volume de graisse silicone, en veillant à ne pas réduire la viscosité en dessous de 10 pascals.

Lorsque la concentration cristalline appropriée a été obtenue, déplacer l’échantillon entier dans une seule seringue et remplacer le coupleur par une aiguille d’injection de 108 microns de diamètre intérieur vissée très fermement dans la base de la seringue. Pour configurer l’injecteur, sélectionnez les outils et le mode de guidage et l’interrupteur de fin de course négatif, démarrez le guidage et laissez le logiciel fonctionner jusqu’à ce que la vis soit suffisamment rétractée pour qu’une seringue de 100 microlitres puisse passer sous la vis. Insérez l’aiguille d’une seringue vide dans la fente du porte-seringue pour monter la seringue sur l’injecteur et alignez la seringue contre le support.

Enroulez un joint torique sur la section médiane de la seringue, en fixant l’anneau aux crochets de chaque côté de la seringue et enroulez un deuxième joint torique autour des crochets sur la partie supérieure de la seringue. Assurez-vous qu’une partie du deuxième joint torique est positionnée sur le dessus de la seringue en verre. Pour préparer la seringue d’échantillon, amorcez la seringue, placez le capuchon de l’injecteur sur la tête du piston de la seringue d’échantillon et chargez la seringue sur l’injecteur.

Déplacez la vis d’entraînement vers le haut du capuchon. Dans le logiciel de contrôle de l’injecteur, sélectionnez le mode de vitesse et activez le mode de vitesse. Réglez la valeur de réglage sur 3 000 tours par minute et cliquez sur Appliquer la valeur de réglage.

Lorsque la vis s’approche du capuchon sur la tête du piston de la seringue, mettez la valeur de réglage à zéro. Une fois le contact établi, cliquez sur appliquer la valeur de réglage pour activer la valeur prédéfinie, en arrêtant la vis instantanément. Ensuite, remuez doucement le capuchon pour vous assurer qu’il est fermement maintenu en place.

Pour faire fonctionner l’injecteur, modifiez la valeur de réglage à 100 tours par minute et inspectez visuellement la pointe pour observer l’échantillon lorsqu’il commence à extruder. Après avoir fermé le clapier, diminuez la valeur de réglage par tranches de 10 jusqu’à ce qu’un flux de matériau lent mais stable soit observé. Si le flux d’échantillon ne s’écoule pas correctement, augmentez la valeur de réglage par incréments de 10 tours par minute jusqu’à ce que le flux devienne plus droit.

Si le flux ne se stabilise pas, insérez un récupérateur d’échantillons en polystyrène sous le flux d’échantillon pour aider à guider l’échantillon. Vous pouvez également insérer un entonnoir d’aspiration Venturi dans le récupérateur d’échantillons, qui peut être connecté au tube de sortie d’air situé dans le clapier du synchrotron australien. Pour déterminer le débit du flux, utilisez le calculateur de débit de l’appareil Lipidico.

Déterminer la vitesse de fonctionnement optimale de l’échantillon pour l’injecteur est crucial pour la stabilité du flux. Un débit lent entraîne une expansion de la graisse silicone qui s’échappe de l’injecteur, tandis qu’un débit plus rapide produit un jet plus fin. L’enroulement du flux de milieu visqueux a été régulièrement observé.

Pour surmonter ce problème dans les échantillons fortement chargés, un récupérateur de polystyrène peut être utilisé pour introduire une faible force électrostatique. Dans cette analyse, une seringue en verre contenant 26 microlitres de cristaux de lysozyme en suspension dans de la graisse silicone a été utilisée. Une quantité suffisante de données a été collectée en 38 minutes, permettant de générer la carte de densité électronique entourant les liaisons disulfure dans la structure du lysozyme.

N’oubliez pas d’utiliser un petit volume d’échantillon sur la lame de verre pour évaluer la concentration cristalline de l’échantillon afin de déterminer si la viscosité doit être corrigée. La polyvalence de l’injecteur permet la caractérisation par rayons X d’autres matériaux très visqueux. Par exemple, des structures de liquide ionique à l’aide de la recherche sur les batteries ou des matériaux colloïdaux à l’aide de produits laitiers.