Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Le protocole montré dans cette vidéo combine pour la première fois l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices biomécaniques pour induire et maintenir la pluripotence dans les cellules adultes différenciées en phase terminale. La principale force de ce protocole est qu’il ne nécessite pas de vecteurs transgéniques ou viraux. De plus, il est robuste, hautement reproductible et flexible.

Cette technique ne nécessite pas l’utilisation de la transfection génique, et représente donc une avancée technologique notable pour la médecine translationnelle et la thérapie cellulaire, tout en soutenant la culture à long terme de cellules à haute plasticité. Georgia Pennarossa, professeure adjointe, et Teresina De Iorio, étudiante au doctorat de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par préparer une solution mère fraîche d’un millimolaire de 5-aza-CR.

Pesez 2,44 milligrammes de 5-aza-CR et dissolvez-le dans 10 millilitres de DMEM à haute teneur en glucose. Remettez la poudre en suspension par vortex et stérilisez la solution avec un filtre de 0,22 micromètre. Préparez une solution de travail de 5-aza-CR en diluant un microlitre de solution mère dans un millilitre de milieu de culture de fibroblastes.

Trypsinisez les cellules comme décrit dans le manuscrit du texte et délogez-les avec un pipetage doux. Récupérez ensuite la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube conique. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage sous microscope optique.

Centrifugez la suspension cellulaire à 150 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension pour obtenir 40 000 cellules dans 30 microlitres de milieu de culture de fibroblastes complété par une micromolaire de 5-aza-CR. Remplissez une boîte de Pétri de 35 millimètres avec de la poudre de PTFE pour produire un lit et distribuez les 30 microlitres de cellules sur le lit de poudre.

Faites pivoter doucement la boîte de Pétri dans un mouvement circulaire pour vous assurer que la poudre de PTFE recouvre entièrement la surface de la goutte de liquide pour former un microbioréacteur de marbre liquide. Prélevez le microbioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 microlitres qui a été découpée pour s’adapter au diamètre du marbre. Placez le microbioréacteur sur une boîte de Pétri en bactériologie propre pour le stabiliser.

Ensuite, transférez le microbioréacteur de la boîte de Pétri dans une plaque à 96 puits. Ajoutez lentement 100 microlitres de média à partir de la marge du puits. Le microbioréacteur doit flotter sur le dessus.

Incuber le microbioréacteur à marbre liquide pendant 18 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, prélevez le microbioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et placez-le dans une nouvelle boîte de Pétri de bactériologie de 35 millimètres. Utilisez une aiguille pour percer la bille liquide et la casser.

Récupérez les sphéroïdes formés à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres qui a été coupée sur le bord au stéréomicroscope. Pour éliminer les résidus de 5-aza-CR, transférez les organoïdes dans une boîte de Pétri contenant un milieu ESC. Préparez une nouvelle boîte de Pétri de 35 millimètres contenant le lit de poudre de PTFE et distribuez un seul organoïde dans une gouttelette de 30 microlitres de milieu de culture ESC sur la poudre à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 200 microlitres.

Faites pivoter doucement la parabole dans un mouvement circulaire pour former un nouveau microbioréacteur en marbre liquide et transférez-la dans un puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez 100 microlitres de média à partir du bord du puits pour baigner lentement le marbre. Cultivez les microbioréacteurs en marbre liquide à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Les analyses morphologiques montrent qu’après une incubation de 18 heures avec l’agent déméthylant 5-aza-CR, les fibroblastes de trois espèces de mammifères encapsulés dans des microbioréacteurs en PTFE se sont agrégés et ont formé des structures sphériques 3D avec une géométrie de taille uniforme. Dans des conditions 3D, 86,31 % des cellules encapsulées ont remarquablement modifié leur phénotype. En revanche, les cellules post-5-aza-CR cultivées dans des conditions standard 2D étaient considérablement plus petites, avec des noyaux granulés et conservaient une distribution monocouche.

Les changements morphologiques ont été accompagnés par le début de l’expression génique liée à la pluripotence, à la fois dans les cellules 3D et 2D post-5-aza-CR. La transcription a été observée pour l’homéobox 1 de classe cinq POU, l’homéobox NANANOG, la protéine à doigt de zinc ZFP42 et la région déterminant le sexe Ybox2, qui sont absentes dans les fibroblastes non traités. Une régulation positive significative de la molécule d’adhésion des cellules épithéliales 10-11 et des gènes de la cadhérine 1 a également été observée dans les cellules 3D post-5-aza-CR par rapport aux cellules cultivées dans des boîtes en plastique standard 2D.

En parallèle, la régulation négative de l’antigène de surface cellulaire Thy1, marqueur spécifique des fibroblastes, a été détectée dans les cellules 3D et 2D post-5-aza-CR. Une diminution significative des niveaux de méthylation dans les cellules 3D et 2D post-5-aza-CR a été confirmée avec ELISA. Les niveaux de méthylation de l’ADN étaient significativement plus faibles dans les cellules 3D post-5-aza-CR par rapport aux cellules cultivées dans des conditions 2D.

De plus, les cellules 3D post-5-aza-CR ont conservé la structure sphérique 3D acquise, des niveaux d’expression élevés des gènes liés à la pluripotence et de faibles niveaux de méthylation de l’ADN pendant 28 jours, après quoi la culture a été arrêtée. Les microbioréacteurs peuvent également être utilisés pour maintenir des conditions optimales pour les cultures de cellules progénitrices, ainsi que pour augmenter l’efficacité de la différenciation terminale.