Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction
26 septembre 2020
Une technique de ballonnement occidental à très grande vitesse est développée en améliorant la cinétique de la liaison antigène-anticorps grâce à la technologie cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) en conjonction avec un agent améliorant l’immunoréaction.
Le Western blot est une méthode établie qui détecte les antigènes sur une membrane transférée et est couramment utilisée dans la recherche biomédicale, mais il faut des heures ou des jours pour terminer l’ensemble de la procédure. En utilisant la combinaison d’une technologie d’immuno-amélioration avec un drainage et un réapprovisionnement cycliques, une fois que vous avez une membrane de bloc, l’ensemble de la procédure peut être accompli en aussi peu que 20 minutes sans sacrifier la sensibilité. Parce que le transfert Western est commun à de nombreux domaines de recherche différents, il a une large applicabilité pour accélérer la recherche.
L’utilisation réussie de ce protocole repose sur l’optimisation de la dilution des anticorps avec une immunoréaction améliorant le réactif et le temps d’incubation. Commencez par incuber les membranes PVDF dans des tampons de blocage appropriés pendant une heure en les agitant à température ambiante. Pendant que les membranes sont en incubation, préparez une solution d’agent d’immunoréaction à 10 % ou IRE1 avec de l’eau distillée et mélangez-la bien, puis diluez l’anticorps primaire avec 10 % d’IRE1, en le mélangeant doucement et soigneusement.
Prélevez la membrane PVDF à l’aide d’une pince à épiler et égouttez brièvement la solution de blocage. Insérez la membrane dans un tube conique avec l’anticorps primaire, en vous assurant que toute la membrane adhère à la paroi du tube et que le côté de la membrane qui était à l’origine en contact avec le gel est tourné vers l’intérieur. Fermez hermétiquement le tube.
Insérez le tube dans une bouteille en verre pour le four d’hybridation et allumez le four. Incuber la membrane avec une rotation de six tr/min pendant au moins cinq minutes. Arrêtez la rotation et retirez délicatement la membrane PVDF du tube à l’aide d’une pince à épiler.
Placez la membrane dans un récipient avec 50 millilitres de PBST et rincez-la, puis rincez-la dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’aucune bulle n’apparaisse, ce qui éliminera la majorité de l’anticorps. Transférez la membrane dans une essoreuse à salade qui contient 250 millilitres de PBST. Placez le panier de la passoire dans l’essoreuse et assurez-vous que le couvercle a été bien installé, puis activez l’essoreuse et faites-la fonctionner pendant 20 à 30 secondes.
Jetez la solution et rincez brièvement l’intérieur de l’essoreuse à l’eau distillée. Ajoutez 250 millilitres de PBST dans l’essoreuse et répétez l’essorage, puis incubez la membrane avec les anticorps secondaires et lavez-la à nouveau comme décrit dans le manuscrit du texte. Placez un morceau de film flexible semi-transparent sur une surface plane.
Mélangez deux composants du substrat chimiluminescent dans un tube de cinq millilitres et transférez immédiatement 1,5 millilitre du substrat mélangé dans le film semi-transparent. Placez la membrane PVDF sur la solution et transférez le reste de la solution de substrat sur la membrane. Incuber la membrane PVDF avec le substrat mélangé pendant une minute.
Prenez la membrane PVDF à l’aide d’une pince à épiler et égouttez brièvement la solution de substrat. Placez la membrane en sandwich entre une paire de films transparents et imagez-la en mode chimiluminescent. Les quantités d’antigène et d’anticorps respectivement nécessaires à la détection chimiluminescente du Western blot sont indiquées ici.
Dans les incubations statiques et CDR, l’utilisation de solutions IRE a augmenté la sensibilité. De même, la concentration minimale d’anticorps anti-6s His tag a été abaissée de 100 à 50 nanogrammes par millilitre dans des conditions statiques et de 100 à 12,5 nanogrammes par millilitre dans des conditions CDR. L’incubation CDR pendant 5 ou 10 minutes a considérablement abaissé la limite de détection par rapport à l’incubation statique.
De plus, l’association de CDR et d’IRE a révélé une sensibilité supérieure sur le Western blot, même pendant la période d’incubation extrêmement courte. L’application réussie de cette méthode à un transfert Western avec détection fluorescente est démontrée ici. La détection fluorescente, contrairement à la détection chimiluminescente, a la capacité unique de détecter plusieurs cibles sur le même transfert en même temps, sans décapage ni résonance des anticorps.
La phosphatase alcaline et la bêta-actine marquées à his dans les lysats cellulaires ont été détectées simultanément à l’aide d’un fluorophore bicolore. L’incubation de CDR avec IRE a non seulement accéléré la détection, mais a également augmenté la sensibilité. Pendant l’incubation, la membrane doit rester attachée à la paroi du tube.
Le tube doit être tourné horizontalement de manière à ce que la solution se lave continuellement sur la surface de la membrane. Ce protocole a considérablement accéléré notre productivité en recherche, qui dépend fortement des procédures de transfert Western.
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Aperçu
Cet article présente une technique de transfert western ultra-rapide qui réduit considérablement le temps nécessaire à la procédure. En utilisant une technologie de drainage et de réapprovisionnement cycliques (CDR) ainsi qu'un agent d'amélioration de l'immunoréaction, l'ensemble du processus peut être réalisé en aussi peu que 20 minutes sans compromettre la sensibilité.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Recherche biomédicale
- Techniques de transfert Western
- Technologie immunopotentiante
Contexte
- Le transfert western est une méthode largement utilisée pour la détection d'antigènes.
- Les protocoles classiques de transfert western peuvent prendre des heures, voire des jours.
- L'amélioration de la rapidité de cette technique peut accroître l'efficacité de la recherche.
- L'étude porte sur l'optimisation de la dilution des anticorps et des durées d'incubation.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole de western blot plus rapide.
- Conserver la sensibilité tout en réduisant la durée de la procédure.
- Démontrer l'applicabilité étendue de la technique dans divers domaines de recherche.
Méthodes utilisées
- Utilisation de la technologie de drainage et de réapprovisionnement cycliques (CDR).
- Incorporation d'un agent d'amélioration de la réaction immunitaire (IRE1).
- Blocage des membranes en PVDF dans des tampons appropriés.
- Optimisation de la dilution des anticorps et des durées d'incubation.
Résultats principaux
- La procédure complète de western blot peut être réalisée en 20 minutes.
- La haute sensibilité est maintenue tout au long du processus.
- Une optimisation réussie permet une détection efficace de l'antigène.
- La méthode présente un potentiel d'utilisation étendue dans divers domaines de recherche.
Conclusions
- La technique développée accélère considérablement le transfert western.
- La combinaison de la technologie CDR avec des agents immunopotenciateurs est efficace.
- Cette avancée peut faciliter des résultats de recherche plus rapides.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Le transfert Western reste une technique fondamentale dans la validation de cibles et l'analyse de biomarqueurs, mais ses longues périodes d'incubation créent des goulots d'étranglement dans les flux de travail de découverte à haut débit. Cette méthode ultra-rapide réduit le temps de dosage de plusieurs heures à 20 minutes tout en préservant la sensibilité, permettant une analyse rapide de l'expression protéique sur plusieurs échantillons. L'approche accélère les tests d'hypothèses et l'identification de candidats prometteurs en améliorant le débit du dosage sans compromettre la qualité des données.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet une interrogation rapide d'hypothèses thérapeutiques grâce à une détection accélérée des protéines.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps par immunotransfert, permettant de cribler davantage de cibles en parallèle lors de la validation précoce des cibles.
- Valeur prédictive : Conserve la sensibilité du test, facilitant des évaluations fiables de l'engagement de la cible et de la modulation des voies.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des données quantitatives et reproductibles d'expression protéique, adaptées à la standardisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec la détection chimiluminescente et fluorescente, permettant le multiplexage et un choix souple des modes de détection.
- Évolutivité : Le format cyclique de vidange et de réapprovisionnement permet une adaptation aux flux de travail automatisés ou semi-automatisés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet une analyse protéique cohérente, de la découverte aux modèles précliniques, en utilisant la même méthode de détection rapide.
- Alignement des biomarqueurs : Facilite l'évaluation des modifications post-traductionnelles et des isoformes protéiques pertinentes pour les mécanismes des maladies.
- Réduction des risques : Accélère la validation des biomarqueurs cibles, réduisant ainsi l'incertitude dans les décisions d'avancement préclinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage de l'interaction avec la cible à l'optimisation du composé précurseur, où la quantification rapide des protéines guide les cycles itératifs de conception.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant une mesure rapide et répétée des niveaux protéiques dans différentes conditions expérimentales.
- Écrantage : Produit des résultats quantitatifs standardisés permettant de comparer la liaison des anticorps selon les conditions et les échantillons.
- Analytique : Offre des limites de détection sensibles (par exemple, une réduction des concentrations d'anticorps requises) qui améliorent le rapport signal/bruit lors de l'analyse de cibles peu abondantes.
- Recherche translationnelle : Permet une surveillance cohérente des protéines dans différents types d'échantillons, soutenant ainsi la validation de biomarqueurs dans des systèmes pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une technique compatible avec une plateforme et applicable à plusieurs projets et domaines thérapeutiques en raison de sa grande compatibilité.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à une détection rapide et reproductible des protéines.
- Valeur opérationnelle : Améliore le débit des laboratoires et l'efficacité des réactifs en réduisant les durées d'incubation et la consommation d'anticorps.
- Valeur stratégique : Permet des décisions plus rapides de poursuite ou d'abandon lors du choix des cibles en accélérant les cycles de production de données.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en fournissant en temps utile des données de validation des cibles pour les décisions d'investissement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une bonne maîtrise des techniques de drainage et de renouvellement cycliques, ainsi que de la manipulation des agents d'amplification des réactions immunitaires.
- Requiert un équipement standard pour le western blot, notamment un four d'hybridation, une essoreuse à salade et des systèmes de détection adaptés aux signaux chimiluminescents ou fluorescents.
- Exige une optimisation des dilutions d'anticorps et des durées d'incubation lors de l'intégration de l'agent d'amplification de la réaction immunitaire.
- Suppose une formation adéquate afin d'assurer une manipulation correcte de la membrane lors des étapes de drainage et de centrifugation, afin de préserver l'intégrité du signal.
- Particulièrement adapté aux laboratoires réalisant fréquemment des western blots, où les gains de temps s'accumulent lors de l'analyse de multiples cibles et conditions.
