Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette
14 janvier 2021
Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.
Cette nouvelle méthode efficace pour isoler les sous-populations de spermatocytes et de spermatods de souris adultes peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la méiose et à la spermatogenèse. Cette méthode utilise un colorant liant l’ADN à faible cytotoxicité avec un large spectre d’excitation qui peut être appliqué à la plupart des ordres FACS actuellement utilisés. Cette méthode est très simple.
L’aspect le plus difficile est la cytométrie du flux, mais la stratégie de gating détaillée devrait aider à adapter le protocole à d’autres trieurs de cellules. Yu-Han Yeh, assistant de recherche au laboratoire de Satoshi Namekawa, démontrera la procédure. Après avoir récolté les deux testicules d’une souris mâle de huit semaines, placez les tissus dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant deux millilitres de PBS glacé et retirez l’albuginea de tunica.
Séparer délicatement les testicules avec des forceps pour disperser légèrement les tubules séminifères. Et transférer les tubules dans une goutte de glace fraîche pbs froid dans une boîte de 100 millimètres Petri. Utilisez les forceps pour démêler doucement les tubules et laver les tubules dans trois gouttelettes supplémentaires de PBS comme nous venons de le démontrer.
Après le dernier lavage, placez les tubules séminifères non emmêlés dans un tube de 15 millilitres, contenant deux millilitres de tampon de dissociation pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette de 1000 microlitres pour pipette doucement les tubules 20 fois, avant de retourner le tube à l’incubateur pendant six minutes supplémentaires. À la fin de l’incubation, pipette les tissus 20 fois supplémentaires, avant de retourner le tube à l’incubateur.
Après trois minutes, pipette doucement les tubules 10 fois ou jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux de tissu visibles, avant d’arrêter la dissociation avec 10 millilitres de tampon FACS. Ensuite, centrifugeuse à la suspension tissulaire deux fois en utilisant un supplément de 10 millilitres pour tampon FACS frais pour le deuxième lavage pour enlever le spermatozoa et autant de débris que possible. Pour tacher les cellules pour l’analyse cytométrique d’écoulement, re-suspendre la pastille en trois millilitres de tampon FACS.
Et filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire en nylon de 70 microns, dans un tube de 50 millilitres. Après dépouillement, transférer 10% des cellules dans un nouveau tube sur la glace comme le contrôle négatif non taché. Et bien mélanger six microlitres de tache DCV dans la suspension cellulaire restante.
Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité avec des secousses douces toutes les 10 minutes, ajouter cinq microlitres de DNase I aux cellules. Et filtrer les cellules à travers une passoire en maille de nylon de 35 microns dans un tube FACS de cinq millilitres sur la glace. Pour l’analyse cytométrique du flux des cellules, créez une nouvelle expérience dans le logiciel d’analyse de flux et, dans le menu des outils de la feuille de travail, cliquez sur une nouvelle densité pour créer une zone de dispersion vers l’avant par rapport à une parcelle de densité de zone de rétroédation à l’échelle linéaire.
Cliquez sur un nouvel histogramme pour créer une trace d’histogramme bleu DCV à l’échelle logarithmique. Et cliquez sur démarrer et enregistrer pour commencer à traiter l’échantillon non taché. Pendant que l’échantillon est en cours d’exécution, cliquez sur le détecteur et les paramètres de seuil pour ajuster les tensions PMT de dispersion avant et latérale pour placer les cellules non tachées sur l’échelle de la parcelle de dispersion avant et arrière.
Ajustez la tension de PMT pour le canal jappy pour localiser la position de la population négative de DCV dans la première décennie de la parcelle logarithmic bleue d’histogramme de DCV. Ensuite, cliquez sur arrêter pour décharger l’échantillon non taché. Après avoir brièvement tourbillonné et chargé l’échantillon taché, cliquez sur le tube suivant pour créer une nouvelle feuille de travail pour l’échantillon.
Réglez le cytomètre pour acquérir au moins une fois 10 pour les six événements, et cliquez sur démarrer et enregistrer. Ensuite, cliquez sur nouvelle densité pour créer la hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la largeur de dispersion avant. Et les parcelles de densité rouge DCV bleu contre DCV à l’échelle linéaire.
Sur la zone de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de densité de la zone de rétrocâpeur, utilisez l’outil polygone pour dessiner une porte appelée cellules pour inclure la plupart des cellules et pour exclure les petits débris. Appliquez cette porte sur la hauteur de dispersion avant par rapport à la parcelle de largeur de dispersion avant et utilisez l’outil rectangle pour dessiner la porte d’une seule cellule pour exclure les cellules non simples. Appliquez la porte de la cellule unique sur la parcelle de densité rouge bleu DCV par rapport à la parcelle de densité rouge DCV et ajustez l’échelle pour capturer un profil étendu.
Utilisez l’outil polygone pour dessiner une porte DCV pour exclure les cellules non tachées et la population latérale, et appliquez la porte sur une parcelle d’histogramme bleu DCV à l’échelle linéaire. Les trois pics majeurs se réfèrent aux différents contenus d’ADN 1C, 2C et 4C. Créez une deuxième parcelle de densité rouge DCV bleue par rapport à la parcelle de densité rouge DCV sur une échelle linéaire.
Et porte arrière de la porte DCV sur la parcelle pour localiser les populations 1C et 4C. Créez une autre parcelle de densité rouge DCV bleue par rapport à la parcelle de densité rouge DCV sur une échelle linéaire. Et utilisez l’outil ellipse pour dessiner une porte sur la population 1C.
Utilisez l’outil polygone pour portailr la population de 4C avec une courbe continue. Et créez une autre parcelle de densité rouge DCV bleue par rapport à la DCV à l’échelle linéaire. Utilisez l’outil polygone pour créer une porte 4C one.
Dans une nouvelle parcelle de dispersion côte à côte, utilisez l’outil ellipse pour créer des portes pachytene, diplotène et leptotene, spermatocyte zygotène. Lorsque toutes les portes ont été dessinées, créez une nouvelle parcelle de point de couleur rouge DCV contre DCV sur une échelle linéaire pour appliquer la porte 4C pour s’assurer que les trois populations sont dans un ordre continu à l’intérieur de la porte. Ensuite, créez une nouvelle zone de dispersion vers l’avant par rapport à une parcelle de densité de zone de rétroscivité à l’échelle linéaire, et sélectionnez la taille unifiée des cellules comme une population de spermatozoïdes ronds purs.
Après le tri, les puretés représentatives des fractions séparées de spermatocyte de leptotene, de zygotène, de pachytene et de diplotène se situent généralement entre 80% et 90%, comme le confirment l’immunostaining SYCP3 et Gamma H2AX. La pureté de la faction ronde spermatid peut être confirmée par la coloration du noyau avec DCV en combinaison avec sp56 et h1t coloration, et est également généralement autour de 90%La viabilité des populations cellulaires isolées est généralement plus de 95%Et les rendements totaux moyens de chaque fraction d’une souris adulte unique est généralement suffisante pour diverses analyses en aval. Les cellules triées peuvent être utilisées pour diverses analyses de séquençage de prochaine génération afin de mieux explorer l’expression et la régulation des gènes pendant la spermatogenèse.
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Aperçu
Cet article présente une méthode simple pour isoler des cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes à partir de testicules de souris adultes. En utilisant un colorant fluorescent à faible cytotoxicité se liant à l'ADN et le tri cellulaire par flux fluorescent (FACS), les chercheurs peuvent obtenir des populations cellulaires spermatogéniques fortement enrichies pour diverses applications.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie de la reproduction
Contexte
- L'isolement des cellules spermatogéniques est essentiel pour l'étude de la méiose et de la spermatogenèse.
- Les méthodes actuelles peuvent entraîner une cytotoxicité élevée, limitant ainsi la viabilité cellulaire.
- Cette méthode vise à améliorer la viabilité cellulaire durant l'isolement.
- Le tri cytométrique par flux est une étape cruciale du processus.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole efficace pour isoler les spermatocytes et les spermatides.
- Faciliter l'étude des mécanismes moléculaires de la méiose.
- Fournir une stratégie de tri détaillée permettant d'adapter le protocole à d'autres cytomètres en flux.
Méthodes utilisées
- Prélèvement des testicules de souris mâles adultes.
- Utilisation d'un colorant de liaison à l'ADN à faible cytotoxicité, excité par une lumière violette.
- Application du tri cellulaire par flux fluorescent (FACS).
- Mise en œuvre d'une stratégie détaillée de sélection en cytométrie en flux.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes.
- Enrichissement élevé des populations de cellules spermatogéniques.
- Démonstration de l'applicabilité de la méthode à divers systèmes de tri cellulaire par flux (FACS).
- Présentation d'un protocole simple à l'intention des chercheurs.
Conclusions
- La méthode améliore la viabilité des cellules germinales isolées.
- Elle constitue un outil précieux pour l'étude de la spermatogenèse.
- Des applications futures pourraient inclure l'analyse des facteurs génétiques et épigénétiques intervenant dans la méiose.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de sous-populations vivantes de cellules spermatogéniques permet une détection mécanistique des cibles en biologie de la reproduction et la découverte de thérapeutiques ciblant la lignée germinale. Cette méthode renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en fournissant des cellules viables de haute pureté pour les analyses omiques et fonctionnelles en aval. Sa compatibilité avec les plateformes FACS standard utilisant un laser violet améliore l'accessibilité et l'extensibilité dans divers protocoles de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques portant sur les voies de la méiose et de la spermatogenèse à l'aide de fractions purifiées de spermatocytes en leptotène/zygotène, en pachytène et en diplotène.
- Valeur opérationnelle : Offre une méthode de marquage à faible cytotoxicité, compatible avec les trieurs cellulaires dotés de laser violet largement disponibles, réduisant ainsi les obstacles liés à l'équipement.
- Valeur scientifique : Facilite la détection biologique des risques grâce à l'isolement de cellules vivantes présentant une viabilité supérieure à 95 %, permettant des analyses fonctionnelles complémentaires.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des mesures quantitatives de la teneur en ADN (1C, 2C, 4C) par coloration au DCV, permettant un tri fondé sur la ploïdie standardisé pour une reproductibilité des dosages.
- Valeur opérationnelle : Facilite la préparation de suspensions monocellulaires à partir de testicules murins, une étape préalable essentielle pour les pipelines de criblage basés sur la cytométrie en flux.
- Valeur scientifique : Permet d'obtenir des fractions hautement purifiées de spermatides et de spermatocytes (pureté de 80 à 90 %), adaptées à des applications en aval reproductibles telles que le RNA-séquençage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit un système pertinent pour l'étude des régulateurs génétiques et épigénétiques de la méiose, soutenant ainsi l'alignement entre cible et hypothèse.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en fournissant des cellules germinales viables pour des études mécanistiques.
- Valeur scientifique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en réduisant l'ambiguïté mécanistique lors de la validation de cibles germinales.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, en particulier pour les thérapeutiques modulant la lignée germinale, où le contexte cellulaire est déterminant.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en isolant des stades méiotiques définis pour un profilage moléculaire.
- Essais de dépistage : Permet la préparation des tests grâce à des protocoles normalisés de dissociation et de coloration, produisant des suspensions cellulaires de qualité reproductible.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives discriminant la ploïdie au moyen de la fluorescence DCV, permettant la comparaison des états cellulaires entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les travaux précliniques en offrant un modèle murin dont la physiologie présente une pertinence translationnelle par rapport à la spermatogenèse humaine.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place un protocole compatible avec la cytométrie en flux (FACS) et réutilisable pour l'isolement de cellules germinales vivantes dans divers projets et catégories cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à une clarté mécanistique dans la progression méiotique.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité par le biais d'une stratégie de tri détaillée et de l'utilisation de colorants faiblement cytotoxiques.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller/arrêt en réduisant les risques biologiques en phase avancée des programmes ciblant la reproduction.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles germinales fondée sur une validation fonctionnelle dans des sous-populations cellulaires purifiées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux pour le réglage des portes et la compensation de la fluorescence dans l'analyse multiparamétrique des VDC.
- Dépend de l'accès à un équipement FACS doté d'une capacité d'excitation par laser violet (405 nm).
- Exige une standardisation du temps de dissociation tissulaire et de la coloration entre les opérateurs et les laboratoires.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation du tampon de dissociation et des conditions d'incubation.
- Limite pratique : la méthode est actuellement validée sur des testicules murins adultes ; son applicabilité aux tissus immatures ou humains nécessite des investigations supplémentaires.
