Name: Démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi à l’aide d’un test de complémentation de la luciférase fractionnée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Découvrez le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour étudier les interactions entre protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dans les cellules HEK293 vivantes. Cette méthode sensible permet de détecter des interactions à faible expression.

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Ce travail a été soutenu par la subvention n° 2016/23/D/NZ3/01314 du Centre national des sciences (NCN), Cracovie, Pologne.

1. Génération de plasmides d’expression
<ol><li>Examiner la topologie membranaire des protéines d’intérêt à l’aide d’un outil de prédiction de topologie.</li>
	<li>Concevoir la stratégie de clonage de manière à ce que les fragments les plus grands et les plus petits fassent face au cytoplasme une fois que les protéines de fusion ont été insérées dans les membranes de Golgi. Si, comme dans le cas présenté ici, les N- et C-termini des protéines d’intérêt sont orientées cytoplasmiquement, marquez les protéines de huit manières possibles (voir Figure 1B). Si N- ou C-terminus d’une ou des deux protéines d’intérêt est luminally orienté, excluez-le du marquage.</li>
	<li>Subcinez les gènes d’intérêt en vecteurs d’expression appropriés (voir Tableau des matériaux) en suivant des protocoles de clonage standard. Remarque : Il est recommandé de tester toutes les orientations possibles, car certaines options de balisage peuvent ne pas fonctionner en raison d’une proximité insuffisante, d’une orientation sous-optimale ou de contraintes spatiales.</li>
</ol>2. Transfection transitoire des plasmides d’expression dans les cellules
<ol><li>Récoltez la culture cellulaire adhérente HEK293T par trypsinisation et ressuspendez les cellules dans un milieu de croissance complet dédié. Plaquez les cellules (2 x 104/100 μL/puits) sur une plaque de 96 puits à fond clair, côté blanc. Ajuster le nombre total de puits pour tenir compte de toutes les combinaisons et de tous les contrôles testés, y compris les répétitions. REMARQUE: Essayez d’utiliser uniquement les 60 puits intérieurs de la plaque pour minimiser les changements thermiques et éviter l’évaporation pendant la nuit. L’utilisation de plaques revêtues de poly-D-lysine est fortement recommandée, telles que celles indiquées dans le tableau des matériaux, sinon les cellules peuvent se détacher lors des étapes de lavage suivantes.</li>
	<li>Cultiver les cellules pendant la nuit dans des conditions normales (37 °C, 5 % de CO2).</li>
	<li>Le lendemain, transfecter les cellules avec les combinaisons souhaitées de plasmides d’expression obtenus au point 1.1.<ol>
<li>Diluer les plasmides d’expression dans un milieu sans sérum (voir tableau des matériaux) à 6,25 ng/μL pour chaque construction.</li>
		<li>Ajouter le réactif de transfection à base de lipides à un rapport lipide/ADN approprié et incuber selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Ajouter 8 μL de mélange lipide/ADN aux puits désignés. Mélanger le contenu de la plaque par rotation douce. Il en résulte une transfection des deux constructions d’expression à 50 ng/puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultiver les cellules pendant 20-24 h dans des conditions standard (37 °C, 5% de CO2). REMARQUE: La culture des cellules pendant une période plus longue peut entraîner des niveaux plus élevés d’expression de la protéine de fusion, ce qui peut favoriser une association non spécifique entre les fragments.</li>
</ol>3. Échange moyen
<ol><li>Le lendemain, remplacez le milieu conditionné par 100 μL d’un milieu sans sérum dans chaque puits. Assurez-vous que les cellules ne se sont pas détachées lors d’un échange moyen. REMARQUE: Cette étape doit être effectuée 2-3 h avant l’ajout de la solution de travail furimazine. Le sevrage sérique minimise le fond causé par l’autoluminescence de la furimazine.</li>
</ol>4. Préparation de la solution de travail furimazine
<ol><li>Juste avant la mesure, mélanger 1 volume de furimazine avec 19 volumes d’un tampon de dilution (une dilution de 20 fois). REMARQUE: Le volume total de la solution de travail de furimazine à préparer dépend du nombre de puits individuels à analyser (la solution de travail de la furimazine est ajoutée au milieu de culture cellulaire dans un rapport de 1:5, par conséquent, à chaque puits préalablement rempli de 100 μL d’un milieu sans sérum, 25 μL de la solution de travail de furimazine doivent être ajoutés).</li>
	<li>Ajouter la solution de travail de furimazine aux puits désignés (25 μL/puits). Mélangez doucement la plaque à la main ou à l’aide d’un agitateur orbital (par exemple, 15 s à 300-500 tr/min).</li>
</ol>5. Mesure de la luminescence
<ol><li>Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques de luminescence.<ol>
<li>Pour les expériences à réaliser à 37 °C, équilibrez la plaque pendant 10 à 15 min à la température indiquée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez les puits à analyser.</li>
	<li>Luminescence de lecture avec un temps d’intégration de 0,3 s. Continuez à surveiller la luminescence jusqu’à 2 h au besoin.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Calculer les valeurs moyennes et les écarts-types pour toutes les combinaisons testées et de contrôle.</li>
	<li>Analysez les données à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec plusieurs comparaisons.</li>
	<li>Calculer les valeurs de changement de pli en divisant une luminescence moyenne obtenue pour les combinaisons d’intérêts par une luminescence moyenne obtenue pour les commandes négatives correspondantes. Évaluez les résultats. NOTE: L’approche de l’analyse des données proposée ici suppose que l’interaction peut être revendiquée si la luminescence obtenue pour la combinaison testée est statistiquement significativement supérieure à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante et, en même temps, le rapport de ces deux valeurs dépasse 10.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous fournissons ici un protocole détaillé permettant la démonstration de complexes hétérologues formés entre des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi, telles que les NST, en utilisant le test de complémentation de la luciférase divisée. L’approche proposée pour l’analyse et l’interprétation des données consiste à relier la luminescence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante, qui est composée de l’une des protéines d’intérêt...

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour vérifier la présence d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dans des cellules humaines transfectées transitoirement en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée. La procédure a été le plus largement testée contre les transporteurs de sucre nucléotidique (NST), mais nous avons également pu obtenir des résultats positifs pour d’autres protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dont les N- et / ou C-termini font face au cytoplasme.
Notre groupe de recherche explore le rôle des NST dans la glycosylation des macromolécules. Les NST sont des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et/ou d’ER avec N- et C-termini faisant face au côté cytoplasmique de la membrane organellaire1. On pense que les NST transportent les sucres activés par les nucléotides à travers les membranes des organites pour fournir aux glycosyltransférases leurs substrats. Les NST forment des dimères et/ou des oligomères supérieurs2,3,4,5,6,7,8,9,10. De plus, des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées6,11. Il a également été démontré que les NST forment des complexes avec des enzymes de glycosylation fonctionnellement liées12,13,14. Nous avons cherché une alternative à la technique actuellement utilisée, l’approche FRET basée sur l’imagerie par fluorescence de la durée de vie (FLIM), pour étudier les interactions des NST et des protéines résidentes de Golgi fonctionnellement apparentées, nous avons donc décidé de tester le test de complémentation de la luciférase fractionnée. Il nous a permis d’identifier une nouvelle interaction entre un NST et une enzyme de glycosylation fonctionnellement liée9.
La modification la plus récente du test de complémentation de la luciférase fractionnée, NanoBiT, est utilisée dans le protocole présenté ici15. Il repose sur la reconstitution de l’enzyme luciférase (par exemple, NanoLuc) à partir des deux fragments - le grand, appelé grand BiT ou LgBiT, une protéine de 17,6 kDa, et le petit, composé de seulement 11 acides aminés, appelé petit BiT ou SmBiT. Les deux protéines d’intérêt sont fusionnées avec les fragments complémentaires et exprimées transitoirement dans une lignée cellulaire humaine. Si les deux protéines de fusion interagissent, une luminescence est produite in situ lors de l’ajout d’un substrat perméable aux cellules. Ces deux fragments ont été optimisés de manière à ce qu’ils s’associent avec une affinité minimale à moins d’être rapprochés par une interaction entre les protéines d’intérêt auxquelles ils sont fusionnés.
En général, les méthodes basées sur la bioluminescence présentent certains avantages par rapport à celles basées sur la fluorescence. Les signaux bioluminescents ont un rapport signal/bruit plus élevé car la luminescence de fond est négligeable par rapport au signal dérivé de la luciférase16. En revanche, les approches basées sur la fluorescence souffrent généralement d’un fond relativement élevé causé par le phénomène d’autofluorescence. En outre, la bioluminescence est moins préjudiciable aux cellules analysées que la fluorescence, car dans le premier cas, il n’est pas nécessaire d’exciter l’échantillon. Pour ces raisons, les approches bioluminescentes pour étudier les IPP in vivo surpassent les méthodes fluorescentes couramment utilisées comme le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) ou la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC).
Notre protocole repose sur la luminescence de référence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin. Ce dernier comprend l’une des protéines testées qui est fusionnée avec un fragment plus grand et une protéine de contrôle (par exemple, HaloTag), fusionnée avec un fragment plus petit. Cette dernière est une protéine d’origine bactérienne qui ne devrait interagir avec aucune des protéines de mammifères. L’utilisation de cette protéine comme témoin pose des limites à la topologie des paires de protéines résidentes de Golgi à analyser. Étant donné que dans les cellules de mammifères, cette protéine est synthétisée dans le cytoplasme, les deux protéines d’intérêt doivent avoir au moins une queue cytoplasmique.
Cette approche peut être particulièrement utile pour le dépistage initial des IPP. Elle peut devenir la méthode de choix lorsque les protéines de fusion d’intérêt sont exprimées à des niveaux tout simplement insuffisants pour que d’autres approches puissent être appliquées. De même, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être la meilleure option si les protéines d’intérêt sont exprimées à des niveaux élevés, mais cela affecte négativement leur localisation subcellulaire ou est connu pour forcer des interactions non spécifiques. Étant donné que le plus petit fragment ne contient que 11 acides aminés, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être appliqué lorsque l’utilisation de marqueurs plus grands est impossible. Enfin, il peut être utilisé pour confirmer davantage les données obtenues à l’aide d’autres techniques, comme dans le cas présenté ici.

<table><tbody><tr>Solution <td></td><td></td><td></td><td>de trypsine-EDTA à 0,25 %</td></tr><tr><td>Lignée</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire de mammifère adhérente</tr><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine 96 puits Blanc/Transparent à fond plat traité TC, avec couvercle</td><td>Corning</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de culture cellulaire</tr><tr><td>Suppléments de culture cellulaire (sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, L-glutamine, pénicilline, streptamycine)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Plasmides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’expression codant pour une ou plusieurs protéines d’intérêt non marquées avec des fragments</td><td></td><td></td><td></td>NanoBiT</tr><tr><td>FuGENE HD Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Lecteur de microplaques (ou un autre lecteur de microplaques à luminescence)</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance dédié à la lignée cellulaire utilisée</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matériaux et réactifs pour le clonage moléculaire standard (bactéries, polymérase thermostable, enzymes de restriction, ADN ligase, matériaux et réactifs pour la purification des acides nucléiques)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT MCS Starter System</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>Ce kit contient des vecteurs permettant de marquer les protéines d’intérêt avec des fragments de NanoBiT à différentes orientations ainsi que le plasmide de contrôle codant pour la protéine HaloTag fusionnée avec SmBiT et une paire de plasmides de contrôle positif.</td></tr><tr><td>Système de dosage de cellules vivantes Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>Ce kit contient de la furimazine, qui est un substrat permettant de détecter l’activité de NanoLuc dans les cellules vivantes, et un tampon de dilution dédié.</td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit Opti-MEM I, sans rouge de phénol</td><td>Agitateur</td><td></td> Gibco 11058021 <td></td></tr><tr><td>Oribital</td> Logiciel pour l’analyse des données (par ex. prisme GraphPad)Thermocycleur <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type iii résidentes de golgi à l’aide d’un test de complémentation de la luciférase fractionnée

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

L’objectif de ce protocole est d’explorer l’applicabilité de la variante la plus récente de la complémentation de la luciférase divisée pour démontrer les complexes hétérologues formés par les transporteurs de sucre nucléotidique (NST). Ces protéines multitransmembranaires résidentes en ER et Golgi transportent les sucres nucléotidiques synthétisés cytoplasmiquement à travers les membranes des organites pour fournir des enzymes qui médient la glycosylation avec leurs substrats. Les NST existent sous forme de dimères et/ou d’oligomères supérieurs. Des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées. Pour vérifier si la technique est adaptée à l’étude du phénomène d’hétéromérisation NST, nous l’avons testée par rapport à une combinaison des deux NST résidents de Golgi dont il a été précédemment démontré qu’ils s’associent par plusieurs autres moyens. Le test de complémentation de la luciférase semble particulièrement adapté à l’étude des interactions entre les protéines membranaires résidentes de Golgi, car il ne nécessite pas de niveaux d’expression élevés, ce qui déclenche souvent une mauvaise localisation des protéines et augmente le risque de faux positifs.

Pour obtenir les données les plus fiables dans cette approche, toutes les combinaisons possibles doivent être testées (voir figure 1). En parallèle, des contrôles positifs et négatifs devraient être inclus. Le témoin positif doit être constitué des deux protéines connues pour interagir, dont l’une est fusionnée avec le plus grand fragment et l’autre est fusionnée avec le plus petit fragment. Le témoin négatif devrait idéalement être constitué des deux protéines membranaires de type III non i...

Le protocole présenté ici vise à démontrer l’apparition d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et les N- et/ou C-termini exposées cytoplasmiquement dans des cellules de mammifères vivants en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée.

Démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi à l’aide d’un test de complémentation de la luciférase fractionnée

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Notre protocole permet d’identifier et d’analyser les interactions entre les protéines multi transmembranaires du réticulum endoplasmique et du complexe de Golgi dans des cellules vivantes à de faibles niveaux d’expression. Le principal avantage de cette technique est sa sensibilité particulière, ce qui permet d’éviter des niveaux de surexpression élevés qui sont souvent préjudiciables à la santé cellulaire et peuvent perturber la localisation subcellulaire des protéines. Récoltez la culture de cellules T HEK293 adhérente par trypsinisation et remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance complet dédié.Placez les cellules sur une plaque à 96 puits à fond transparent et à côté blanc. Ajustez le nombre total de puits pour tenir compte de toutes les combinaisons et de tous les contrôles testés, y compris les répétitions. Ensuite, cultivez les cellules pendant la nuit dans des conditions standard.Le lendemain, transfectez les cellules avec les combinaisons souhaitées de plasmides d’expression. Diluez les plasmides dans un milieu sans sérum à 6,25 nanogrammes par microlitre pour chaque construction et ajoutez le réactif de transfection à base de lipides. Ajoutez un rapport lipide/ADN approprié.Incuber les plasmides selon les instructions du fabricant. Ensuite, ajoutez huit microlitres du mélange d’ADN lipidique dans les puits désignés. Mélangez le contenu de la plaque avec une rotation douce et cultivez les cellules pendant 20 à 24 heures dans des conditions standard.Le lendemain, remplacez le milieu conditionné dans chaque puits par 100 microlitres d’un milieu sans sérum, en vous assurant que les cellules ne se détachent pas lors de l’échange de milieu. Juste avant de mesurer la luminescence, mélangez un volume de furimazine avec 19 volumes d’un tampon de dilution. Ajoutez 25 microlitres de la solution de travail de la furimazine dans chaque puits et mélangez doucement la plaque à la main ou avec un agitateur orbital.Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques à luminescence et équilibrez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Sélectionnez les puits à analyser et lisez la luminescence avec un temps d’intégration de 0,3 seconde. Continuez à surveiller la luminescence jusqu’à deux heures si nécessaire.Ce protocole a été testé sur deux transporteurs de sucre nucléotidique, SLC35A2 et SLC35A3, qui sont des protéines membranaires de type trois résidentes de Golgi avec des extrémités N et C face au cytoplasme. Il y avait huit options de marquage possibles et les protéines de fusion résultantes pouvaient être assemblées de huit manières possibles. Les unités de luminescence relatives moyennes ou valeurs RLU correspondant à toutes les combinaisons testées et de contrôle sont indiquées ici.Les valeurs RLU obtenues pour trois des combinaisons étaient significativement plus élevées que celles obtenues pour la combinaison témoin correspondante. Pour obtenir les valeurs de rapport pour les combinaisons d’intérêt, les valeurs RLU ont été divisées par les valeurs RLU obtenues pour les témoins respectifs. Les rapports entre 10 et 1000 sont très révélateurs d’interactions spécifiques.Il y avait deux combinaisons de ce type qui soutenaient l’idée que SLC35A2 et SLC35A3 interagissent. Pour confirmer ces données, les SLC35A2 ou SLC35A3 marquées HA ont été co-exprimées avec la combinaison qui a donné la luminescence relative la plus élevée. Des quantités variables de plasmides et de variants de NST codants marqués à l’HA ont été utilisés pour la co-transfection, ce qui a entraîné une diminution statistiquement significative des valeurs de RLU en fonction de la dose.La chose la plus critique est de s’attaquer à votre intérêt personnel protéique de toutes les manières possibles et de tester toutes les combinaisons possibles, car une certaine orientation de marquage peut produire des résultats faussement négatifs. Une fois que la combinaison la plus performante a été sélectionnée, la dynamique de l’interaction correspondante peut être surveillée pour, par exemple, identifier les agents ou les conditions qui perturbent votre complexe d’intérêt au fil du temps.

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Ici, nous décrivons les procédures pour l'étude des changements dans la phagocytose induite par l'expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur utilisant le système à double GloTM Luciferase Assay de Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

La localisation subcellulaire des protéines est important dans la détermination de la régulation spatio-temporelle de la signalisation cellulaire. Ici, nous décrivons bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) comme une méthode simple pour le suivi des interactions spatiale des protéines dans la cellule.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Une procédure efficace pour évaluer la propension d'oligomérisation des domaines transmembranaires un seul passage (TMDS) est décrite. Des protéines chimères comprenant le TMD fusionnée à ToxR sont exprimés dans une souche E. coli journaliste. TMD induite oligomérisation provoque la dimérisation du ToxR, activation de la transcription et la production de la protéine rapporteur,-galactosidase.

Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR

Nous avons développé un test de fusion cellulaire qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion membranaire activé par l'expression de la β-galactosidase.

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Cette vidéo montre le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour détecter les interactions protéine-protéine. Dans cet essai, les protéines d’intérêt sont associées à de petits et de grands fragments de l’enzyme luciférase. Lorsque les protéines interagissent, les grands et les petits fragments se combinent pour former un complexe enzymatique actif, qui, en présence d’un substrat spécifique, libère une luminescence brillante qui peut être mesurée.

Essai de complémentation de la luciférase fractionnée pour identifier des interactions protéine-protéine spécifiques

La localisation précise des résidents de l’appareil de Golgi est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi. Toutefois, la microscopie optique conventionnelle est incapable de résoudre la structure sub-Golgi. Nous décrivons ici le protocole pour une méthode de Super-résolution microscopie conventionnelle basée déterminer quantitativement la localisation sup-Golgi d’une protéine.

Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

Ici, nous montrons comment utiliser un test de ligature de proximité (PLA) pour visualiser MST1/MST2 hétérodimérisation dans les cellules fixes à haute sensibilité.

Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature

Nous présentons ici un biocapteur axée sur la luciférase afin de quantifier l’activité kinasique de suppresseur de tumeur grande (LAT)-une centrale kinase dans l’hippopotame voie de signalisation. Ce biocapteur a diverses applications en recherche fondamentale et translationnelle vise à déterminer l’Hippo voie régulateurs in vitro et in vivo.

Hippo, activité de voie à l’aide d’un biocapteur de suppresseur (LATS) axée sur la luciférase grande tumeur de signalisation de surveillance

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes qui permettrait à l’utilisateur d’évaluer la perturbation induite par les médicaments de la dynamique complexe eIF4F dans les formats de dépistage.

Surveillance de l’assemblage eIF4F en mesurant l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

Essai de réassemblage de la luciférase fractionnée pour mesurer les contacts du réticulum endoplasmique et des mitochondries dans des cellules vivantes

Découvrez le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour étudier les interactions entre protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dans les cellules HEK293 vivantes. Cette méthode sensible permet de détecter des interactions à faible expression.

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