Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

Cette méthode identifie les micro-organismes conjonctivaux oculaires viables, ce qui est difficile en raison de l’environnement hostile des yeux. Il peut aider à déterminer s’il existe un microbiome oculaire et comment la présence bactérienne change dans les maladies oculaires. Contrairement au séquençage de l’ADN, qui identifie à la fois les micro-organismes viables et non viables, cette méthode n’identifie que les micro-organismes viables, ce qui permet de mieux comprendre la communauté commensale oculaire.

Les études suggèrent que les maladies oculaires difficiles à diagnostiquer telles que l’œil sec non autoimmun et autoimmun aient une présence bactérienne oculaire unique. Cette méthode pourrait être utilisée pour diagnostiquer les maladies oculaires avec des signatures microbiennes distinctives. Commencez par autoclaver la quantité appropriée de battages de coton et de cure-dents pour le nombre de souris à écouvillons, puis pincez 1/2 un centimètre de long morceau de pâte de coton et taquinez-le en tirant sur les bords pour former une couche poreuse unique plate s’arrêtant juste avant que la batte ne s’effondre.

Faites pivoter la batte autour de l’une des extrémités pointues du cure-dent en tenant légèrement la pièce étirée sur la pointe du cure-dent car elle est tordue. L’écouvillon fini aura une très fine couche de coton tendue sur la pointe s’étendant sur environ 1/2 à un centimètre de la pointe. Insérez les écouvillons dans un petit bécher, écouvillonnez le côté vers le bas, puis couvrez-les et autoclavez-les.

Nettoyez l’aire de travail avec un désinfectant pour minimiser la contamination et aliquotez 0,5 millilitres d’infusion stérile de cœur cérébral, ou des milieux BHI dans des micro-tubes à centrifuger stériles étiquetés de 1,5 millilitre. Coiffez les tubes dans un rack et réglez le rack sur la glace. Configurez le flux de travail de gauche à droite en commençant par la station d’anesthésie de la souris, qui contient la cage avec les souris expérimentales, la cage stérile vide, l’anesthésie à température ambiante, l’aiguille de calibre 25 et une seringue d’un millilitre.

Ensuite, préparez une station d’écouvillonnage qui contient le BHI aliquoted sur la glace, des écouvillons stérilisés, des gouttes oculaires lubrifiantes, un récipient à biorisque, des serviettes en papier propre et un spray à 70% d’isopropanol. Enfin, configurez la station de placage avec des plaques de gélose au sang à température ambiante, une pipette de 10 microlitres, 10 embouts jetables stériles microlitres et un conteneur de déchets à biorisque. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en serrant un coussinet arrière.

Ne continuez que s’il n’y a pas de mouvement. Assignez une main pour manipuler les souris anesthésiées et les autres mains pour manipuler l’écouvillon oculaire et la culture. Retirez la souris de la cage et placez-la sur la surface de travail positionnée sur le côté avec l’œil gauche exposé.

Vaporisez l’isopropanol aux mains gantées et séchez-les avec une serviette en papier. Décapez le tube micro-centrifugeuse BHI étiqueté avec la main de manipulation du support dédiée et replacez les deux dans le rack. Trempez la pointe enduite de coton de l’écouvillon dans le BHI, puis retirez l’écouvillon du tube tout en faisant tourbillonner la pointe deux fois contre la chambre à air pour éliminer l’excès de liquide et l’enlever.

Avec la main de manipulation de la souris, tenez doucement la souris par la peau du cou. D’autre part, placez le bout de l’écouvillon de l’œil contre la région conjonctivale médiale de l’œil gauche. Relâchez légèrement le globe oculaire et déplacez l’écouvillon dans un mouvement de lavage de fenêtre entre la paupière inférieure et l’œil 10 fois, en maintenant une pression constante.

Sans toucher la fourrure, retirez doucement la pointe de l’écouvillon perpendiculairement à l’endroit où il a été inséré. Placez le côté coton-tige vers le bas, directement dans un tube micro-centrifugeur étiqueté avec un support BHI. Appliquez un goutte oculaire sur l’œil écorché.

Si vous le souhaitez, acquérir des écouvillons de peau ou de fourrure pour les échantillons témoins, en stérilisant les gants de manière appropriée entre chaque écouvillon. Lorsque vous avez terminé, retournez la souris dans la cage. Laissez l’écouvillon reposer pendant 10 à 15 minutes sur de la glace, puis stérilisez les mains gantées et retirez l’écouvillon tout en mélangeant la pointe dans le support pendant 10 rotations.

Retirez l’écouvillon en faisant tourbillonner la pointe contre la paroi interne du tube pendant cinq rotations et jetez-le dans un récipient à biorisque. Répétez le processus pour chaque souris. Enrichir l’échantillon en incubant le tube statiquement pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Pendant l’incubation, étiquetez une plaque de TSA à température ambiante par écouvillon de souris ou écouvillon de contrôle et divisez-la en deux. Retirez les échantillons enrichis de l’incubateur et placez-les sur de la glace. Vortex brièvement les échantillons à mélanger, puis aliquote 10 microlitres de l’échantillon sur la plaque TSA et incliner la plaque pour former une bande.

Répétez cette opération deux fois. De l’autre côté de la ligne de séparation des plaques, créez 10 points avec 10 microlitres d’échantillon chacun. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 heures, deux jours et quatre jours dans une chambre propre qui empêche les plaques de gélose de sécher.

Comptez les colonies dans les bandes. Notez la morphologie et calculez les unités formant colonies par écouvillon pour les isolats morphologiquement similaires. Regardez les points où des organismes uniques ne sont pas capturés dans les bandes.

Pour faciliter la visualisation, nous avons plaqué les bactéries densément dans les plaques du milieu et de droite. Typiquement, nous avons observé beaucoup moins de bactéries dans les plaques d’écouvillonnage oculaire. Notez qu’à l’occasion, les écouvillons oculaires peuvent ne pas produire de bactéries récupérables.

Une plaque représentative d’écouvillonnage d’oeil avec les isolats morphologiquement divers d’une souris noire de six C57 est montrée ici. Pour chaque isolat distinct, les colonies ont été comptées dans la bande et l’abondance relative a été calculée et tracée. Pour la caractérisation microbiologique, les bactéries ont été prélevées à partir de plaques d’écouvillonnage individuelles pour les yeux de souris afin de produire une plaque TSA maîtresse.

Lorsque la croissance est apparue, des tests supplémentaires ont été effectués pour caractériser ou identifier les microbes. La plaque maîtresse a été utilisée pour fournir suffisamment d’inoculum pour élargir les isolats respectifs. Pour identifier des isolats, un plat de TSA a été strié et incubé pendant la nuit, et la milliseconde de MALDI-TOF a été exécutée.

Des exemples d’isolats présentés ici ont été identifiés comme streptocoques acidominimus et Aerococcus viridans. Des niveaux significativement différents d’organizations commensales ont été récupérés de six souris noires C57 mâles et femelles. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagule les staphylocoques négatifs et E.coli ont été isolés chez les souris noires C57 six N.

Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que le meilleur résultat sera obtenu en recouvrant l’écouvillon finement et en prenant le temps pendant le pas de l’écouvillonnage oculaire. Si l’accès à la SP MALDI-TOF est limité, les isolats peuvent être identifiés par des tests microbiologiques et biochimiques.