Name: Un ex Vivo Choroid Sprouting Assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Découvrez l'essai de bourgeonnement choroïdien ex vivo pour étudier l'angiogenèse microvasculaire oculaire et la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Cette méthode permet d'évaluer les traitements pharmacologiques et les voies de signalisation impliquées.

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Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), du Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, de la Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, du BCH Pilot Award, de la BCH Manton Center Fellowship et de la Little Giraffe Foundation (ZF), de la German Research Foundation (DFG; à BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH CRDI (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital (numéro de protocole ARCH 19-04-3913R).
1. Préparation
<ol><li>Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (10000 U/mL) et 5 mL et 10 mL de suppléments disponibles dans le commerce à 500 mL de milieu classique complet avec sérum. Aliquot 50 mL du milieu initialement. REMARQUE : Ne retournez aucun milieu au stock pour éviter la contamination.</li>
	<li>Mettez un aliquot de milieu classique complet sur la glace.</li>
	<li>Utilisez 70 % d’éthanol pour nettoyer le microscope, les forceps et les ciseaux disséquants.</li>
	<li>Préparer deux plats de culture cellulaire (10 cm), l’un au microscope à dissection, l’autre sur glace; mettre 10 mL de milieu classique complet dans chaque plat.</li>
</ol>2. Étapes expérimentales (Figure 1)
<ol><li>Sacrifier les souris C57BL/6J autour de la kétamine postnatale (P) 20 à l’aide de kétamine de 75 à 100 mg/kg et de 7,5 à 10 mg/kg de xylazine injectée intraperitoneally. Gardez les yeux dans le milieu classique complet sur la glace avant la dissection.</li>
	<li>Enlever le tissu conjonctif (muscle et tissu adipeux) et le nerf optique sur l’œil.</li>
	<li>Utilisez un micro-ciseaux pour couper circonférentiellement 0,5 mm postérieur au limbus cornéen. Retirer le complexe cornée/iris, vitreux et la lentille.</li>
	<li>Faire une incision de 1 mm perpendiculairement au bord de coupe vers le nerf optique et couper une bande circonférentielle de 1 mm de largeur. Séparez les régions centrales et périphériques du complexe. Utilisez des forceps pour décoller la rétine du complexe RPE/choroid/sclera.</li>
	<li>Gardez la bande choroïde périphérique dans un milieu classique complet sur la glace; isoler l’autre œil et répéter le processus pour couper une deuxième bande.</li>
	<li>Couper la bande circulaire en 6 ~morceaux carrés égaux (~1 mm x 1 mm). REMARQUE : Ne touchez jamais à aucun bord.</li>
	<li>Décongeler l’extrait de membrane basale (BME) par instruction de fabrication. Ajouter 30 μL/puits de BME au centre de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Assurez-vous que la gouttelette de BME forme un dôme convexe au bas de la plaque sans toucher les bords. REMARQUE : Décongeler le BME toute la nuit au réfrigérateur. Le BME doit être sur la glace à tout moment après le dégel.</li>
	<li>Placez le tissu au milieu du BME. REMARQUE : N’aplatissez pas l’explantation choroïde; généralement, laissez le tissu se développer dans le BME. L’orientation du tissu (côté sclérical vers le haut ou vers le bas) n’a pas d’impact sur les résultats expérimentaux.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min pour laisser le gel se solidifier.</li>
	<li>Ajouter 500 μL du milieu/puits classique complet.</li>
	<li>Changez le médium classique tous les deux jours (500 μL). La germination choroïde peut être observée après 3 jours au microscope. REMARQUE : Pour le traitement des facteurs de croissance, affamer le tissu pendant 4 h. Diluer un composé d’essai dans un milieu à facteur de croissance réduit (1:200 boost au lieu de 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT-Choroid méthode informatisée de quantification17 (Figure 2)
REMARQUE : Une méthode informatisée pour mesurer la superficie couverte par les navires en croissance a été utilisée. Un plugin macro au logiciel ImageJ est nécessaire avant la quantification (voir informations complémentaires pour plus de détails).
<ol><li>Ouvrez l’image de germination choroïde avec ImageJ et vérifiez "Image | Le type| 8-bit" à l’échelle grise.</li>
	<li>Aller à "Image | Ajuster | Luminosité/Contraste (Ctrl/shift/C)" et optimiser le contraste.</li>
	<li>Utilisez la fonction baguette magique pour décrire et enlever de l’image le tissu choroïde qui sont présents au centre des germes (en utilisant la clé raccourcie "F1« ) (Figure 2A,B). REMARQUE : Réglez le taux de tolérance de la baguette magique à 20-30%.</li>
	<li>Supprimez l’arrière-plan de l’image avec les outils de sélectiongratuits ( Figure 2C). Aller à "Image | Ajuster | Seuil (Ctrl/shift/T)« . Utilisez la fonction seuil pour définir les germes microvasculaires en arrière-plan et en périphérie (Figure 2D).</li>
	<li>Cliquez sur" F2" et un résumé apparaîtra. Enregistrez une image de la zone sélectionnée en cliquant sur "Enregistrer« . Enregistrer dans le même dossier que l’image d’origine pour la référence future.</li>
	<li>Une fois qu’un groupe d’échantillons est mesuré, copiez l’enregistrement pour analyse de données. REMARQUE : Il est également possible de mesurer la zone (μm²) par «Analyser | Set Scale" à l’aide d’images avec barres d’échelle.</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas de divulgation financière. La méthode informatisée est disponible gratuitement aux établissements d’enseignement par l’intermédiaire des auteurs.

L’analyse choroïdienne de germination aide la recherche dans amd néovasculaire9,10,18,19,20. Les explantations choroïdes peuvent être isolées de souris ainsi que de rats etd’humains 17,21. L’explant choroïde comprend les CE, les macrophages et les péricytes17. Dans cet essai l’i...

La dysrégulation choroïde d’angiogenèse est associée à la dégénérescence maculaire relative à l’âge néoovasculaire (DME)1. Le choroïde est un lit microvasculaire présent sous l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Il a été démontré que la réduction du flux sanguin dans le choroïde est associée à la progression de la D AMD2. La relation complexe entre l’endothélium vasculaire, l’EPR, les macrophages, les péricytes et d’autres cellules est responsable de l’homéostasiedu tissu 3,4,5. Par conséquent, un microenvironnement choroïdien reproductible de modélisation d’essai est critique pour l’étude de la DMO néovasculaire.
Les analyses d’angiogenèse ex vivo et les cultures cellulaires endothéliales in vitro peuvent compléter les études sur le comportement microvasculaire in vivo, pour tester de nouveaux médicaments et pour des études sur la pathogénie. Les cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs), les cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC), le cerveau animal primaire isolé ou les CE rétiniens sont souvent utilisées dans des études in vitro pour la recherche sur l’angiogenèseoculaire 6,7,8. Les HRMEC en particulier ont été largement utilisés comme modèle de néovascularisation choroïdienne in vitro (CNV)9 en évaluant la prolifération endothéliale, la migration, la formation tubulaire et les fuites vasculaires pour évaluer les interventions6,10. Cependant, les CE en culture sont limités comme modèle de CNV en raison du manque d’interactions avec d’autres types de cellules trouvés dans le choroïde et parce que la plupart des EC utilisés dans ces analyses ne proviennent pas de choroïdes. Les CE choroïdes de souris sont difficiles à isoler et à maintenir dans la culture.
L’essai aortique d’anneau est employé couramment comme modèle de prolifération vasculaire macro. Les pousses vasculaires provenant d’explants aortiques comprennent les CE, les péricytes et les macrophages11. L’essai d’anneau aortique modèle le grand angiogenèse denavire bien 12,13,14. Cependant, il a des limitations comme modèle de néovascularisation choroïdienne car les anneaux aortiques sont un tissu macrovasculaire dépourvu de l’environnement microvasculaire choroïde caractéristique, et les germes des grands vaisseaux peuvent différer des germes des réseaux capillaires impliqués dans la pathologie microvasculaire. Récemment, un groupe a publié un essai rétinien ex vivo15,16. Bien qu’il soit approprié pour la maladie néovasculaire rétinienne, il n’est pas aussi approprié pour la néovascularisation choroïde comme vu dans AMD.
L’essai choroïde de germination utilisant le RPE de souris, le choroïde, et le tissu explanté sclérical a été développé pour mieux modéliser CNV. Le tissu peut facilement être isolé des yeux de souris (ou d’autres espèces)17. Cet essai permet l’évaluation reproductible du potentiel pro- et anti-angiogenic des composés pharmacologiques et l’évaluation du rôle des voies spécifiques dans la néovascularisation choroïde utilisant le tissu des souris génétiquement modifiées et contrôle18. Cet essai choroïde de germination a été référencé dans beaucoup de publicationssuivantes 9,10,18,19,20. Ici, la méthode impliquée dans l’utilisation de cet essai sont démontrées.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de membrane basale (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr><tr><td>Milieu classique complet avec sérum et systèmes cellulaires CultureBoost</td><td></td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique 200 Proof</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>utilisation pour 70 % </td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire (24 puits)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (Kétamine)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

un ex vivo choroid sprouting assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

L’angiogenèse choroïde pathologique, une caractéristique saillante de la dégénérescence maculaire relative à l’âge, mène à l’affaiblissement de vision et à la cécité. Les tests de prolifération des cellules endothéliales (EC) utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs) ou des EC rétiniennes primaires isolées sont largement utilisés dans des modèles in vitro pour étudier l’angiogenèse rétinienne. Cependant, isoler les cellules endothéliales rétiniennes murines pures est techniquement difficile et les CE rétiniens peuvent avoir des réponses de prolifération différentes que les cellules endothéliales choroïdes et les différentes interactions cellule/cellule. Un essai choroïdien choroïde fortement reproductible de germination comme modèle de prolifération microvasculaire choroïde a été développé. Ce modèle inclut l’interaction entre la vascularisation choroïde (EC, macrophages, péricytes) et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les explants rpe/choroïdes/scléraux de souris sont isolés et incubés dans l’extrait basal de membrane croissance-facteur-réduit (BME) (jour 0). Le milieu est changé tous les deux jours et la germination choroïde est quantifiée au jour 6. Les images de l’explantation choroïde individuelle sont prises avec un microscope de phase inversée et la zone de germination est quantifiée à l’aide d’un plug-in macro semi-automatisé au logiciel ImageJ développé dans ce laboratoire. Cet essai reproductible de germination choroïde ex vivo peut être employé pour évaluer des composés pour le traitement potentiel et pour la recherche microvasculaire de maladie pour évaluer des voies impliquées dans la prolifération choroïde de micro navire utilisant le type sauvage et le tissu génétiquement modifié de souris.

Comparaison de la croissance de la germination choroïde par jour
Nous avons disséqué le choroïde avec de la sclérienne, incrusté dans le BME et les avons cultivés pendant 6 jours( Figure 1). La germination choroïde chez les souris C57BL/6J du jour 3 au jour 6 a été examinée au microscope et quantifiée avec SWIFT-Choroid une méthode de quantification semi-automatisée dans ImageJ. Dans un cas représentatif, la zone choroïde de germination (les vaiss...

Ce protocole présente l’essai choroïde de germination, un modèle ex vivo de prolifération microvasculaire. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdiens et évaluer les traitements médicamenteux à l’aide de tissus de souris sauvages et génétiquement modifiés.

Un ex Vivo Choroid Sprouting Assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Ce test choroïde est hautement reproductible et pertinent pour la recherche sur l’angiogenèse choroïdienne et la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la DMLA. Ce test peut être utilisé pour cribler des composés en tant que traitements potentiels de la DMLA néovasculaire ou pour évaluer les voies impliquées dans la néovascularisation choroïdienne à l’aide de tissus de souris de type sauvage et génétiquement modifiés. Pour commencer, ajoutez cinq millilitres de pénicilline, de streptomycine et 10 et cinq millilitres de suppléments disponibles dans le commerce à 500 millilitres de milieu classique complet avec sérum, puis aliquote 50 millilitres du milieu décongèlent l’extrait de membrane basale ou BME pendant la nuit dans un réfrigérateur à deux à huit degrés Celsius.Mettez une aliquote de milieu classique complet sur de la glace. Nettoyez le microscope de dissection, la pince et les ciseaux avec de l’éthanol à 70 %. Préparez des boîtes de culture cellulaire et placez-les l’une sur le microscope de dissection et l’autre sur de la glace.Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu classique complet à chaque plat. Garder les yeux en milieu classique complet sur glace avant la dissection. Retirez le tissu conjonctif et le nerf optique, puis utilisez un micro-ciseau pour couper circonférentiellement 0,5 millimètre en arrière du limbe cornéen.Retirer la cornée du complexe de l’iris, du vitré et du cristallin. Faites une incision d’un millimètre perpendiculaire au bord coupé vers le nerf optique et coupez une bande circonférentielle d’un millimètre de large, puis séparez les régions centrale et périphérique du complexe. Utilisez une pince pour décoller la rétine du complexe de la sclérotique choroïde RPE.Maintenez la bande choroïde périphérique en milieu classique complet sur de la glace. Isolez l’autre œil et répétez l’opération pour couper une deuxième bande. Coupez la bande circulaire en cinq à six morceaux carrés à peu près égaux.Ajoutez 30 microlitres de BME décongelé au centre de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Assurez-vous que la gouttelette de BME forme un dôme convexe au bas de la plaque sans toucher les bords. Placez le tissu au milieu de l’abdomen.N’aplatissez pas la plante choroïde X. Laissez le tissu se dilater à l’intérieur de l’EMO. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour laisser le gel se solidifier, puis ajoutez 500 microlitres de milieu classique complet dans chaque puits.Changez le support classique tous les deux jours. La germination de la choroïde peut être observée après trois jours au microscope. Ouvrez l’image de germination choroïde avec l’image J et vérifiez l’image, le type et le huit bits avec l’échelle de gris.Optimisez ensuite le contraste en sélectionnant l’image, ajustez, le contraste de luminosité et ajustez-le. Utilisez la fonction de baguette magique pour délimiter et retirer le tissu choroïde qui est présent au centre des pousses. Supprimez l’arrière-plan de l’image avec les outils de sélection gratuits.Ensuite, allez dans l’image, ajustez le seuil et utilisez la fonction de seuil pour définir les pousses microvasculaires sur l’arrière-plan en périphérie. Cliquez sur F2 et un résumé apparaîtra. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer une image de la zone sélectionnée dans le même dossier que l’image d’origine pour référence future.Une fois qu’un groupe d’échantillons a été mesuré, copiez les données enregistrées pour l’analyse. Ce protocole a été utilisé pour examiner et quantifier la germination de la choroïde chez les souris C 57, six noires J du troisième au sixième jour. Dans un cas représentatif, la surface de germination choroïdienne était de 0,38, 1,47, 5,62 et 10,09 millimètres carrés aux jours trois, quatre, cinq et six, respectivement.Les effets de la perte de FFAR4 sur la germination vasculaire choroïdienne ont été évalués à l’aide du test de germination choroïde chez des souris FFAR4 quatre knock-out et FFAR4 de type sauvage. La zone de germination chez les souris knock-out FFAR4 a augmenté la croissance vasculaire choroïdienne par rapport au type sauvage FFAR4 au sixième jour. De plus, le traitement avec un agoniste micromolaire de FFAR4 a réduit la zone de germination choroïdienne par rapport aux souris non traitées au sixième jour.Ce test permet d’évaluer de manière reproductible le potentiel anti-angiogénique des composés pharmacologiques et la variation du rôle d’une voie spécifique dans la néovascularisation choroïdienne à l’aide de tissus de souris génétiquement modifiés.

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