Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

SM FISH quantifie avec précision les niveaux et la localisation de RNase spécifique. Cette méthode est particulièrement utile pour analyser la variation de l’ARN d’une cellule à l’autre et allèle par allèle. La transcription des gènes est un processus essentiel en biologie cellulaire, SM FISH permet d’étudier le contenu de l’ARN en réponse à des stimuli externes au niveau de la cellule unique et de fournir des informations spatiales.

Après un traitement par agoniste des récepteurs aux œstrogènes, lavez les cellules avec du PBS stérile à froid avec du calcium et du magnésium et fixez les cellules avec 500 microlitres de tampon de fixation pendant 30 minutes sur de la glace. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS stérile à froid avec du calcium et du magnésium pendant trois minutes avant d’ajouter 500 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque puits. Scellez ensuite la plaque à 24 puits avec un film plastique de paraffine et placez la plaque sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre et jusqu’à 16 heures.

Pour l’hybridation ARN FISH, à la fin de l’incubation, laver une fois les cellules avec 500 microlitres de tampon 2X SSC complété par 10 % de formamide pendant cinq minutes à température ambiante sur un rotateur. Pendant l’incubation, placez un morceau de film plastique de parffin côté non exposé vers le haut dans une boîte de Pétri en verre nettoyée avec un décontaminant de surface à ARN et placez-le sur des serviettes en papier stériles saturées d’eau le long des bords de la boîte. À la fin de l’incubation, placez des gouttelettes de 30 microlitres régulièrement espacées de l’intron GREB1 et du tampon de sonde d’exon GREB1 fraîchement préparés sur le côté propre du film plastique de paraffine et utilisez une pince stérile pour placer délicatement un morceau de couverture de cellules côté cellule vers le bas sur chaque gouttelette sans bulles.

Après avoir scellé le plat avec un film plastique de paraffine, couvrez l’assiette de papier d’aluminium et incubez l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius sur une surface plane non rotative. Le lendemain matin, à l’aide d’une pince, remettez les lamelles de recouvrement sur la plaque à 24 puits, côté cellule vers le haut, pour deux lavages de 15 minutes dans 500 microlitres de tampon frais 2X SSC complété par 10 % de formamide par lavage à 37 degrés Celsius sur un rotateur chauffé. Après le deuxième lavage, contre-colorez l’ADN avec un microgramme par millilitre de DAPI dans un tampon SSC 2X pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur, suivi d’un lavage de cinq minutes dans un tampon SSC 2X à température ambiante.

Utilisez une serviette en papier pour retirer l’excès de tampon SSC 2X et rincez les échantillons dans de l’eau sans nucléase pour éliminer l’excès de sel. Ensuite, utilisez un support de montage non durcissant pour monter les lamelles sur des lames de verre et scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent. Pour l’imagerie d’échantillons, chargez la lame avec l’intensité la plus élevée attendue sur une platine de microscope à épifluorescence à grand champ équipée d’un objectif à huile 60 ou 100 fois dans une caméra sCOMS et placez une gouttelette d’huile d’immersion sur l’objectif.

Pour l’acquisition Zstack, concentrez-vous sur l’échantillon dans le canal DAPI et sélectionnez le haut et le bas du Zstack aux distances auxquelles les noyaux colorés au DAPI deviennent flous. Utilisez la diapositive pour optimiser la quantité d’éclairage de la source lumineuse et les temps d’exposition pour chaque canal, et acquérez des images de toutes les diapositives dans des conditions qui évitent le blanchiment des photos et/ou la saturation des pixels de l’appareil photo. Après l’acquisition, utilisez 10 cycles d’un algorithme de restauration agressif pour déconvolution des images et sauvegardez toutes les images de projection en fonction de la profondeur de bits de la caméra utilisée.

Pour l’analyse d’image, téléchargez d’abord Jupiter Notebook à partir de GitHub et installez Python Anaconda Distribution version 3.6 ou ultérieure. Ouvrez l’invite Anaconda et entrez la commande d’installation pour installer SimpleITK pour Anaconda. Ouvrez Anaconda Navigator et lancez Jupiter Notebook.

Un navigateur Web s’ouvrira et affichera des répertoires et des fichiers. Parcourez les structures de répertoires pour accéder au répertoire contenant le bloc-notes Jupiter téléchargé à partir de GitHub. Ouvrez ensuite le bloc-notes et appuyez sur Maj et Entrée pour exécuter chaque cellule.

Dans cette expérience représentative, des cellules cancéreuses du sein adhérentes ont été traitées avec un agoniste des récepteurs d’œstrogènes, ou véhicule, pendant 24 heures. Des ensembles de sondes séparées spectralement contre des séquences introniques et exoniques de GREB1 ont permis la visualisation et la quantification simultanées d’ARNm naissants et matures. Il est important de noter que le nombre d’allèles transcriptionnellement actifs dans chaque cellule dont il a été démontré qu’ils font partie de l’évolution du temps de réponse aux œstrogènes peut être marqué.

En comptant les taches d’intron et d’exon qui se chevauchent, il a été déterminé que les cellules traitées à l’E2 présentaient une fraction quatre fois plus élevée de cellules présentant deux allèles GREB1 actifs ou plus par rapport aux cellules traitées par véhicule. Comme les introns sont épissés à partir d’ARNm naissant pour produire un ARNm mature composé uniquement de séquences d’exons, le nombre d’ARNm matures par cellule peut être compté en quantifiant le nombre de taches vertes. Le tracé de ces données permet ensuite d’observer le changement de distribution des cellules matures d’ARNm GREB1 et le changement de pli agrégé de la population cellulaire après le traitement par E2.

C-FISH permet d’étudier plusieurs espèces d’ARN de manière séquentielle, MERFISH est une technique de codage à barres pour augmenter massivement le multiplexage, et iFISH est utilisé pour étudier simultanément l’ARN et les protéines.