Optimisation de la croissance cristalline pour la cristallographie macromoléculaire neutronique

Il existe différentes approches de cristallisation pour l’obtention de cristaux de grande et de haute qualité pour la cristallographie aux rayons X et aux neutrons. L’une de ces approches consiste à utiliser la méthode de dialyse. Dans cette technique, la solution protéique est séparée d’une solution précipitée par une membrane semi-perméable.

Les molécules précipitantes se diffusent à travers la membrane dans la chambre protéique. Lorsque la supersaturation correcte pour une nucléation spontanée est atteinte, les premiers noyaux apparaîtront. Ici, nous allons démontrer un protocole qui peut être utilisé par OptiCrys un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire qui utilise la cristallisation de dialyse à température contrôlée, et nos boutons de micro dialyse pour la croissance de gros cristaux de haute qualité pour la cristallographie macromoléculaire naturelle basée sur la connaissance du diagramme de phase de cristallisation.

Pour un bouton de micro dialyse avec certains tuyaux de volume microliter 35 microlitres de solution lysozyme dans la chambre de dialyse. Ce volume supplémentaire crée une forme légèrement dôme sur le dessus de la chambre de dialyse et empêche la formation de bulles d’air. Prenez un applicateur et placez l’élastique ou l’anneau à l’extrémité de celui-ci.

Placez la membrane sur le dessus de la chambre et fixez-la en transférant l’élastique ou l’anneau de l’applicateur à la rainure du bouton de dialyse. Transférez le bouton au puits contenant la solution de cristallisation. Couvrir le puits d’un slip de couverture en verre ou d’un morceau de ruban adhésif.

Gardez l’échantillon à 293 Kelvin dans un incubateur de régulateur thermique sans vibrations. Sachant que la cristallisation de la dialyse offre des avantages du point de vue de la croissance du cristal, le banc de cristallisation dit OptiCrys a été conçu et développé dans notre laboratoire pour offrir un contrôle combiné entièrement automatisé de la température et de la composition chimique de l’expérience de cristallisation biomoléculaire. L’optimisation de la croissance du cristal par OptiCrys est basée sur les diagrammes de phase de concentration des précipités de température.

La nucléation se produit dans la zone de nucléation à proximité de la zone métastable et la croissance du cristal se produit ensuite dans la zone métastable après diagramme de phase, jusqu’à ce que la concentration de protéines atteigne la courbe de solubilité représentant l’équilibre thermodynamique entre la solution et les cristaux. En diminuant la température en cas de protéine avec solubilité directe ou en augmentant la concentration de précipitation en cas de salage atteignant, la solution de cristallisation reste dans la zone métastable et aucune nucléation ne se produit. Les cristaux poussent jusqu’à ce que le deuxième équilibre de solution cristalline atteigne et après cela, aucune autre augmentation de la taille des cristaux n’est observée.

La diminution de la température ou l’augmentation de la concentration de précipitation sont répétées plusieurs fois jusqu’à ce que les cristaux atteignent la taille désirée. Ajouter la solution protéique à la chambre de dialyse de la température contrôlée qui coule, couvrir la chambre avec la membrane de dialyse et fixer la membrane avec l’élastique ou l’anneau. Retournez la chambre et placez-la sur la chambre de dialyse.

Appuyez doucement et lentement pour enlever tout l’air emprisonné entre deux morceaux, fixer le réservoir en sa position en le vissant doucement sur le dessus de la chambre au-dessus. Ajouter la solution de cristallisation à la chambre du réservoir et la couvrir par le bouchon hermétique. Transférer cet assemblage et l’insérer dans le support mammaire du banc de cristallisation OptiCrys Crystal growth est un logiciel de supervision du Banc de Cristallisation OptiCrys.

Il comprend quatre interfaces graphiques ou vues différentes. La vue d’accueil contient des boutons pour naviguer vers les autres vues. Le but de l’interface de configuration est de définir un scénario d’expérience qui peut être exécuté automatiquement dans la vue de test.

La dernière vue est la vue maintenance. Pour redémarrer une expérience, la vue maintenance doit être ouverte où se trouvent tous les paramètres essentiels pour le bon déroulement des expériences de cristallisation. Augmenter la luminosité de la section lumière, la lumière peut augmenter de zéro, pas de lumière à 100 luminosité maximale.

Pour le contrôle et la surveillance de la température, la section régulateur de température est utilisée. Cliquez sur le bouton pour l’allumer. Réglez la température sur la section de point défini et appuyez sur entrez.

Sous ce bouton, il y a deux graphiques. Le rouge montre la finale, la température de commande et le graphique jaune montre la température actuelle. Mélangeant une solution de stock, une injection de la solution de cristallisation à la chambre du réservoir est contrôlée par la section Palm.

Ajouter la concentration de la solution de stock dans la première étape. Ensuite, trouvez la concentration finale de chaque nouvelle solution de groupeur et ajoutez-les à la section de concentration finale. Après avoir appuyé sur le bouton calculer, découvrez le volume de la solution stock sera calculé et ajoutera dans le panneau de volume en face de chaque panneau de concentration.

Appuyez sur le bouton de préparation du lancement et attendez que la nouvelle solution premier ministre soit prête. Pour échanger la solution de cristallisation, cliquez sur le bouton Entrée de la solution. Pour arrêter le processus, appuyez sur le bouton Stop Distribution.

Sur le côté droit de la section microscope, Il existe plusieurs panneaux pour enregistrer des informations importantes de chaque expérience de croissance cristalline. Ajoutez le nom correspondant de protéines, le poids moléculaire et l’état de cristallisation dans cette section. Définissez un nom pour vos expériences en le tapant simplement sur le nom du dossier.

À partir de la section images nb, sélectionnez le nombre d’images qui doivent être prises pendant l’expérience. Ajoutez le nombre d’images et à partir du panneau sur la droite, choisissez l’échelle de la mise à jour. Cliquez sur le bouton dossier pour ouvrir le dossier.

Dans ce dossier, il y a un fichier texte contenant toutes les informations que vous avez précédemment définies pour votre expérience. Les images prêtes pour tout autre traitement sont également enregistrées dans ce dossier. Le zoom arrière sur le microscope peut également être modifié automatiquement.

Modifie votre zoom en utilisant le bouton plus et moins sur le dessus de la section microscope pour augmenter ou diminuer le grossissement respectivement. Il existe trois façons différentes de mesurer la taille du cristal. Pour mesurer la longueur ou la largeur, utilisez le vecteur de largeur.

Selon la forme cristalline, les outils spécifiques de la partie gauche de la section microscope peuvent être choisis. Comme un rectangulaire ou un polygone. Les valeurs apparaîtront dans la section mesure.

Dans la première série d’expériences, les boutons de microdialyse ont été immergés dans les solutions de cristallisation avec différentes concentrations de sel. Dans cette simple expérience de grille de cristallisation, la seule variable est la concentration précipitée. tandis que la température est maintenue constante.

De légères variations de la concentration de sel permettent d’étudier le diagramme de phase de cristallisation en augmentant la concentration de sel de 0,7 à 1,2 augmentation de la sursaturation molaire et la solution dans la zone de nucléation s’éloigne de la zone métastable. Par conséquent, une variation de taille et de nombre de cristaux est observée avec l’augmentation du nombre de cristaux et la diminution de leur taille. Dans la première expérience avec OptiCrys dans l’état expérimental donné, une fois que l’équilibre dans la chambre de dialyse atteint, la solution de cristallisation est dans la zone de nucléation à proximité de la zone métastable du diagramme de phase de cristallisation.

Par conséquent, seuls quelques noyaux sont générés au cours de la première phase de l’expérience. Afin de maintenir la croissance des cristaux dans la zone métastable et de contrôler le processus de croissance du cristal, la température a été modifiée à différents intervalles de temps. Chaque fois que l’équilibre de la solution cristalline était terminé, la température était variée.

Par conséquent, la température a diminué à 291 Kelvin, 288 Kelvin et enfin 275 Kelvin pour maintenir la croissance du cristal sélectionné dans la zone métastable. Le résultat de cette expérience est un seul gros cristal, avec le volume requis pour la cristallographie macromoléculaire naturelle. Les deux expériences suivant démontrent la réversibilité des expériences de dialyse à température contrôlée pour la nucléation, la croissance des cristaux, la dissolution et la repousse.

Dans la deuxième expérience avec OptiCrys, la composition chimique de la solution de cristallisation a été maintenue constante tout au long de l’expérience et la température a varié. La température initiale a été fixée à 291 Kelvin. En raison de la sursaturation élevée, un grand nombre de petits cristaux sont apparus dans la chambre de cristallisation.

Conformément au concept de solubilité protéique directe, en augmentant progressivement la température à 313 Kelvin tous les cristaux devaient se dissoudre. Enfin, en abaissant la température à 295 Kelvin, la deuxième nucléation a commencé à proximité de la zone métastable et a permis de contrôler le processus de nucléation entraînant la formation d’un nombre inférieur de noyaux. Une nouvelle croissance cristalline a permis de générer la population uniforme de cristaux plus gros.

Dans cette expérience, changer la composition chimique de la solution de cristallisation à température constante conduit à obtenir une population uniforme de cristaux plus gros. La condition de cristallisation était semblable à l’expérience précédente. La dissolution des cristaux a été réalisée en abaissant progressivement la concentration de NaCl de 0,9 molaire à zéro.

La réduction de la concentration de sel maintient la solution dans la zone sous-saturée du diagramme de phase qui conduit à la dissolution des cristaux. Ensuite, la nouvelle solution de cristallisation avec une résistance ionique inférieure à celle précédemment a été injectée dans la chambre du réservoir. À cette concentration précipitée, le nombre de cristaux apparaît plus faiblement et les cristaux atteignent un volume plus important qu’auparavant.

Ici, nous avons fourni un protocole détaillé décrivant la préparation de l’échantillon et l’ajustement du logiciel de contrôle pour la culture de cristaux de grande et haute qualité pour la cristallographie macromoléculaire naturelle à l’aide d’un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire. Cette procédure étape par étape a été conçue et bénéficie de la connaissance du diagramme de phase de cristallisation afin de séparer la nucléation et la croissance cristalline. En outre, un protocole pour la croissance des cristaux avec des modèles de microcytose est également présenté en utilisant des boutons de macrocytose comme une alternative lorsque OptiCrys n’est pas disponible.

En plus des stratégies que j’ai mentionnées pour OptiCrys changer la composition chimique de la solution de cristallisation et la température et de prendre des images doit être fait manuellement. L’utilisation de la vibration thermique régulée pour l’incubateur pour maintenir la température constante est nécessaire, ce qui est une étape critique dans la méthodologie démontrée.