Isolement de liquides proximaux pour étudier le microenvironnement tumoral de l’adénocarcinome pancréatique
5 novembre 2020
Le suc pancréatique est une source précieuse de biomarqueurs du cancer du pancréas humain. Nous décrivons ici une méthode de procédure de collecte peropératoire. Pour surmonter le défi de l’adoption de cette procédure dans des modèles murins, nous suggérons un échantillon alternatif, le liquide interstitiel tumoral, et décrivons ici deux protocoles pour son isolement.
La méthode décrite ici pour isoler le liquide proximal chez l’homme et chez la souris peut être appliquée à l’étude du microenvironnement du cancer du pancréas afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs de la maladie. En utilisant ce protocole simple, il est possible de traduire les résultats cliniques du suc pancréatique en modèles murins de PDAC pour effectuer des études mécanistes. Le suc pancréatique est un liquide corporel largement inexploré qui s’est avéré prometteur en tant que source de biomarqueurs précieux pour aider au diagnostic préopératoire et au profilage des patients.
Je ferai la démonstration de la première partie du protocole, et Marialuisa Barbagallo, postdoc de notre laboratoire, fera la démonstration de la deuxième partie du protocole. Estimez l’emplacement du canal pancréatique à l’aide des mesures acquises lors de l’imagerie. Palpez ensuite la surface antérieure du pancréas pour identifier son emplacement précis.
Tenez la tête pancréatique dans le duodénum par le dessous et élevez-la avec la main gauche, en marquant l’emplacement du canal pancréatique avec le premier doigt. Utilisez la main droite pour insérer une seringue de trois millilitres avec une aiguille de calibre 25 dans le pancréas, juste distale par rapport au pouce gauche. Décidez de la profondeur de pénétration et du degré d’inclinaison de l’aiguille en fonction des mesures préopératoires et de la perception d’avoir pénétré la paroi du conduit.
Retirez le jus à l’aide de la seringue. S’il n’est pas possible de récupérer le jus, déplacez l’aiguille pour tenter de canuler le canal pancréatique. Une fois que le suc pancréatique est récupéré, déplacez-le à l’extérieur du champ stérile et transférez-le dans un tube à essai sous vide EDTA de trois millilitres.
Maintenez le tube à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’échantillon soit transféré au laboratoire. Pour traiter le suc pancréatique, centrifugez-le à 400 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer toutes les cellules ou débris. Récupérez le surnageant, aliquotez-le et stockez-le à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que des analyses plus approfondies soient effectuées.
Pour isoler le liquide interstitiel tumoral ou TIF, par centrifugation, coupez la tumeur en deux, rincez les deux parties dans du PBS et épongez-les doucement sur du papier filtre, en vous déplaçant aussi vite que possible pour éviter l’évaporation de la tumeur. Transférez immédiatement la tumeur dans une passoire à cellules en nylon de 20 micromètres, fixée à un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez le tube à 400 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Récupérez le TIF au fond du tube, puis aliquotez-le et congelez-le immédiatement sur de la glace sèche. Conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Pour isoler le TIF à l’aide de l’élution, coupez la tumeur en petits morceaux avec des ciseaux ou un scalpel et rincez-les soigneusement avec du PBS froid.
Transférez les morceaux de tumeur dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 500 microlitres de PBS avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase pour éviter la dégradation des analytes. Incuber le tissu pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et effectuez une série d’étapes de centrifugation à quatre degrés Celsius pour retirer toutes les cellules de l’échantillon.
Récupération du surnageant après chaque centrifugation et transfert dans un nouveau tube. Après la dernière centrifugation, aliquote et congélation immédiates de l’échantillon TIF sur de la glace carbonique. Conservez-le à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie.
Ce protocole a été utilisé pour obtenir le suc pancréatique de patients atteints de PDAC et d’autres affections pancréatiques bénignes. Après avoir filtré les signaux RMN larges des macromolécules, les signaux des métabolites de faible poids moléculaire étaient apparents. L’analyse OPLS-DA supervisée a montré que le profil métabolique du suc pancréatique était capable de faire la distinction entre les patients PDAC et les patients non PDAC avec une précision de 82,4 %.
Pour démontrer que le contenu du liquide interstitiel tumoral reflète de manière fiable les changements dans le microenvironnement tumoral, deux lignées cellulaires de cancer du pancréas avec des taux glycolytiques opposés ont été injectées par voie sous-cutanée à des souris. Après l’excision des tumeurs, les concentrations de glucose et de lactate ont été quantifiées. Le liquide interstitiel tumoral des tumeurs hautement glycolytiques contenait moins de glucose et plus de lactate par rapport aux tumeurs à faible glycolyse.
Dans cette étude, nous avons effectué une analyse métabolomique. Cependant, ces fluides proximaux conviennent à de nombreuses autres applications en aval, telles que la spectrométrie de masse et le profilage des microARN.
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Aperçu
Cet article présente une méthode pour la collecte peropératoire de jus pancréatique, une source précieuse de biomarqueurs pour le cancer du pancréas. De plus, il introduit un échantillon alternatif, le liquide interstitiel tumoral, ainsi que des protocoles pour son isolement dans des modèles murins.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Découverte de biomarqueurs
Contexte
- Le jus pancréatique est peu exploité comme source de biomarqueurs.
- Il présente un potentiel pour faciliter le diagnostic préopératoire.
- Comprendre le microenvironnement du cancer du pancréas est essentiel.
- La traduction des résultats des études chez l'humain à des modèles murins peut améliorer la recherche.
Objectif de l'étude
- Isoler le jus pancréatique et le liquide interstitiel tumoral en vue de l'identification de biomarqueurs.
- Fournir des protocoles applicables aux modèles humains et murins.
- Faciliter les études mécanistiques du cancer du pancréas.
Méthodes utilisées
- Prélèvement peropératoire de jus pancréatique.
- Isolation du liquide interstitiel tumoral.
- Techniques d'imagerie pour localiser le canal pancréatique.
- Palpation du pancréas pour une identification précise.
Résultats principaux
- Protocoles démontrés pour l'isolement de fluides.
- Mis en évidence le potentiel du jus pancréatique comme source de biomarqueurs.
- Montré la faisabilité de la traduction des observations cliniques à des modèles murins.
- Fourni une base pour des études mécanistiques futures.
Conclusions
- Le jus pancréatique et le liquide interstitiel tumoral sont prometteurs pour la recherche de biomarqueurs.
- Les protocoles peuvent améliorer la compréhension du cancer du pancréas.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer tout le potentiel de ces fluides.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement du liquide proximal permet une interrogation directe du microenvironnement du carcinome adénocarcinomateux du pancréas, offrant une voie vers la découverte de biomarqueurs qui fait le lien entre les observations cliniques et les études mécanistiques précliniques. En proposant des méthodes techniquement accessibles pour la collecte de jus pancréatique et de liquide interstitiel tumoral chez l'humain comme chez la souris, le protocole soutient les efforts de validation de cibles et de développement de tests axés sur les altérations du microenvironnement. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en fournissant des liquides pertinents pour la maladie, reflétant les interactions entre cellules tumorales et stromales, et en éclairant les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin dans les programmes de découverte de médicaments contre le cancer du pancréas.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en isolant des fluides qui concentrent des biomarqueurs de l'environnement tumoral.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système pertinent pour la maladie afin de valider fonctionnellement des cibles à l’aide de biomarqueurs présents dans les fluides proches de la tumeur.
- Valeur scientifique : Permet une détection mécanistique des risques grâce à l'analyse comparative de phénotypes tumoraux glycolytiques par la quantification du glucose et du lactate dans le liquide interstitiel tumoral (TIF).
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Prépare des fluides biologiques validés pour des applications en aval telles que la spectrométrie de masse et le profilage des microARN.
- Valeur opérationnelle : Propose des protocoles d'isolement standardisés et reproductibles (centrifugation et élution) adaptés à l'augmentation d'échelle des tests.
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives de métabolites permettant la détection de biomarqueurs prêts pour le criblage, avec une capacité discriminante (précision de 82,4 % en OPLS-DA).
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit une continuité pertinente pour la maladie en transposant les découvertes issues du jus pancréatique humain à des modèles murins de liquide interstitiel tumoral.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation préclinique par l'isolement du liquide interstitiel tumoral à partir de modèles de tumeurs sous-cutanées reflétant des modifications du microenvironnement.
- Valeur stratégique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en reliant les profils de biomarqueurs dans le liquide au phénotype tumoral.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la continuité de la découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés d'intérêt, permettant un profilage du microenvironnement qui éclaire les études mécanistiques et les campagnes de criblage guidées par des biomarqueurs.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en isolant des fluides reflétant les interactions stroma-tumorales dans le CPAD.
- Dépistage : Permet la préparation des tests grâce à l'isolement standardisé du LIT et du jus pancréatique, produisant des sorties quantitatives de métabolites et d'acides nucléiques.
- Analytique : Fournit des biomarqueurs mesurables (glucose, lactate, métabolites) pour l'analyse comparative selon les conditions et le criblage phénotypique.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la continuité préclinique en démontrant que le LIT reflète l'état glycolytique tumoral dans des modèles murins.
- Réutilisation institutionnelle : Établit une capacité réutilisable d'isolement de fluides proximaux dans les systèmes humain et murin, réduisant ainsi les obstacles à la traduction entre modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à la détection de biomarqueurs microenvironnementaux et à la validation ciblée dans le CPAD.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité par des techniques simples de centrifugation et d'élution pour l'isolement du LIT.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'orientation (aller ou ne pas aller) en reliant les biomarqueurs fluides au phénotype tumoral, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque basée sur des profils fluides discriminants de biomarqueurs (précision de 82,4 % dans le CPAD par rapport au non-CPAD).
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation chirurgicale des fluides et en dissection tumorale pour l'isolement du fluide proximal.
- Exige un équipement de centrifugation (400 G, 4 °C) et une manipulation stérile des fluides pour le traitement du jus pancréatique et du TIF.
- Implique une standardisation interéquipes entre les équipes chirurgicales, de pathologie et analytiques afin de préserver l'intégrité des échantillons.
- Suppose des adaptations pour l'isolement du TIF murin par centrifugation ou élution, selon la taille du tissu et l'application ultérieure.
- Comprend des limites pratiques telles que la difficulté technique de la collecte du jus pancréatique chez la souris, rendant nécessaire l'utilisation du TIF comme substitut.
