Une méthode efficace pour la production d’adénovirus

Bienvenue à l’Institut de biologie cellulaire et de pathologie, Nicolae Simionescu de Bucarest, Roumanie. Ici, dans le laboratoire de transduction virale, nous montrons une partie de la production de particules adénoviraux en utilisant une méthodologie optimisée basée sur le système AdEasy développé par le professeur Vogelstein. Les principales étapes de la technologie de production de ces adénovirus sont, d’une part, une recombinaison de pAdTrack contenant de la GFP avec le plasmide pAdEasy-1 dans les bactéries BJ5183.

Deux, l’emballage des particules adénoviraux. Trois, amplification de l’adénovirus dans les cellules AD293. Quatrièmement, la purification des particules adénoviraux à partir du lysat cellulaire et du milieu de culture.

Cinq, titrage viral et test fonctionnel de l’adénovirus. Ici, nous présenterons une étape importante de la méthodologie. La purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture.

La purification de l’adénovirus commence par la récolte des cellules productrices du virus et du milieu. Des cellules AD293 ont été transfectées avec le plasmide de recombinaison et pendant que l’adénovirus a été emballé. Puis l’adénovirus a été amplifié par les grandes cultures successives.

Ici, nous avons obtenu 25 plaques T175, et nous avons commencé la purification de l’adénovirus à partir du lysat cellulaire et du milieu de culture. Tout d’abord, nous avons vérifié la fluorescence verte de la GFP exprimée par les cellules transduites. Si les cellules sont toujours attachées, nous les détacherons en tapant le plat de culture ou en utilisant un long grattoir.

Les cellules et le milieu sont collectés. Les flacons sont lavés avec du PBS, qui est également collecté dans des tubes Falcon. Les cellules sont en granulées par centrifugation.

Conservez le culot cellulaire ainsi que le milieu pour une purification ultérieure de l’adénovirus. À cette étape, l’aide d’un collègue est bien appréciée pour accélérer le processus de récolte. Le culot cellulaire est vert en raison de l’expression GFP.

La pastille est remise en suspension dans un tampon Tris hypertonique, ce qui faciliterait la perturbation des cellules. Pour la lyse cellulaire, nous utilisons de l’azote liquide et le gaz sec réchauffé à 37 degrés. Ne pas effectuer plus de trois cycles car le virus serait endommagé.

Pour augmenter l’efficacité de la perturbation cellulaire, passez soigneusement la cellule à homogénéiser à travers une aiguille de seringue de calibre 23. Centrifuger le lysat cellulaire à 9 600 x g pendant 12 minutes. Passez le surnageant dans de nouveaux tubes et jetez les pastilles.

Gardez le surnageant sur la glace pour un traitement ultérieur par ultracentrifuge. Maintenant, nous traitons le milieu de culture pour isoler l’adénovirus libéré par les cellules. Pour cela, tout d’abord, nous pondérons la quantité nécessaire de sulfate d’ammonium et l’ajoutons à la bouteille dans laquelle le milieu de culture a été collecté.

La bouteille est agitée vigoureusement jusqu’à ce que les cristaux soient complètement dissous. Le mélange est incube à température ambiante pendant deux heures et demie. Ensuite, la suspension du précipité est divisée en tubes Falcon.

Centrifuger pendant 15 minutes à 1 600 x g. Après la centrifugation, le surnageant est jeté et le culot est ressuscité dans un tampon Tris 10 millimolaires. Si l’on ne peut pas continuer la purification de l’adénovirus avec l’étape d’ultracentrifugation, le précipité peut être conservé pendant quelques jours à quatre degrés, mais seulement après dialyse pour éliminer le sulfate d’ammonium.

Ici, nous avons présenté l’étape de dialyse. Nous utilisons une seringue pour introduire la suspension dans une cassette préalablement mouillée. Les échantillons sont dialysés contre un tampon Tris 10 millimolaire pendant une nuit à quatre degrés.

La dernière étape de la purification est représentée par l’étape d’ultracentrifugation sur un gradient discontinu de chlorure de césium. Pour former le gradient, tout d’abord, nous pipettes trois millilitres de la solution haute densité de chlorure de césium. Sur cette couche, versez doucement trois millilitres de chlorure de césium de faible densité.

La suspension de particules adénoviraux du lysat cellulaire ou du milieu de culture est ensuite superposée au-dessus du gradient. Les tubes sont remplis d’huile minérale et introduits dans les seaux SW41. Après l’équilibration, les tubes sont chargés symétriquement dans le rotor, qui est introduit dans l’ultracentrifuge.

La centrifugeuse fonctionne à 35 000 tr / min et quatre degrés pendant 18 heures sans pause. Après ultracentrifugation, les tubes sont placés sur un support avec un papier noir derrière afin de récolter les bandes. La phase supérieure claire et les débris cellulaires sont jetés dans un conteneur à déchets avec une solution de blanchiment.

La bande la plus basse contenant l’adénovirus complet est récoltée avec une pointe de pipette et recueillie dans un tube Eppendorf stérile. Après la dialyse, le saccharose est ajouté à la suspension virale à une concentration finale de 4% et les aliquotes virales sont maintenues congelées à moins 80 degrés. Dans la section des résultats, nous avons montré l’expression de la GFP dans les cellules transduites avec l’adénovirus obtenu.

48 heures après la transduction, la GFP est exprimée par les cellules transduites comme le montre la microscopie à fluorescence. Le pourcentage des cellules exprimant la GFP est déterminé par cytométrie de flux. Environ 50% des cellules endothéliales humaines et bovines transduites avec 25 unités de transduction par cellule sont GFP positif.

Le même rendement de transduction a été obtenu pour les hépatocytes murins lorsque seulement cinq unités de transduction par cellule ont été utilisées, mais cela est associé à une mortalité plus élevée en raison de la sensibilité cellulaire. Réduit à l’expression de GFP a été obtenu par la transduction des cellules stromal mesenchymal dues à la basse expression des récepteurs spécifiques. Observations finales.

Nous optimisons ces technologies laborieuses pour réduire le temps, les coûts et les efforts nécessaires pour obtenir les particules adénoviraux. L’adénovirus préparé est capable d’infecter différents types de cellules et d’induit l’expression du gène d’intérêt.