Dépistage in Vivo CRISPR/Cas9 pour évaluer simultanément la fonction génétique dans la peau de la souris et la cavité buccale

Ce protocole est important car il permet aux chercheurs de sonder simultanément les fonctions suppressives de tumeurs de centaines de gènes dans le cancer de la tête et du cou à une fraction du coût d’un modèle murin knock-out conventionnel. Cette technique est flexible et peut être adaptée pour couvrir l’expression des gènes afin d’étudier leur fonction dans la peau. Le protocole de bibliothèque CRISPR ciblé peut également être appliqué à d’autres types de cancer.

Placez l’animal anesthésié, côté ventral vers le haut, sur la scène de chirurgie chauffée et utilisez du ruban chirurgical pour maintenir les pattes en place. Appliquez le tube d’anesthésie pour un apport constant d’isoflurane et d’oxygène jusqu’à la fin de la chirurgie. Pour confirmer la grossesse E9.5, appliquez une petite quantité de crème dépilatoire sur l’abdomen et étalez-la sur une zone de trois centimètres carrés sur trois à l’aide d’un applicateur à embout de coton.

Après deux à trois minutes, retirez délicatement la crème avec de la gaze ou un mouchoir en papier et essuyez la zone avec du PBS et de l’éthanol à 70 %. À l’aide de la sonde à ultrasons et du gel, vérifiez que la souris enceinte est à la recherche du jour embryonnaire E9.5. Cela peut également être fait la veille à E8.5 pour gagner du temps le jour de l’intervention.

Retirez le gel à ultrasons et essuyez la zone avec du BPS puis de l’éthanol à 70 %. Injectez le plus d’analgésique sous-cutané. Ensuite, vous utilisez des pinces et des ciseaux stériles pour faire une incision verticale dans la peau.

Utilisez des pinces émoussées pour séparer la peau autour de l’incision du péritoine. Ensuite, vous utilisez des pinces et des ciseaux stériles pour couper le péritoine. À l’aide d’une pince émoussée, retirez doucement les cornes de l’utérus gauche et droit et comptez les embryons.

Réinsérez la plupart des cornes utérines, mais laissez l’extrémité distale d’une corne utérine contenant trois embryons exposée. À l’aide d’une pince émoussée, poussez et tirez doucement l’utérus avec les trois embryons, à travers l’ouverture de la membrane en silicone de la boîte de Pétri modifiée. Stabilisez la boîte de Pétri à l’aide de cubes de pâte à modeler.

Stabilisez l’utérus avec les trois embryons à l’intérieur de la boîte de Pétri, à l’aide d’un moule en silicone. Aplatissez ensuite le bouchon en silicone sur le côté des embryons à l’aide d’un outil émoussé. Remplissez la boîte de Pétri avec du PBS stérile et rincez la membrane en silicone au fond de la boîte de Pétri, avec le ventre de la mère enceinte, évitant ainsi toute fuite.

Déplacez la tête d’échographie dans la boîte de Pétri, à environ 0,5 centimètre au-dessus de l’embryon supérieur et ajustez le stade de sorte que la cavité amniotique devienne clairement visible dans la vue de l’échographie. Alignez soigneusement l’aiguille de l’injecteur dans la boîte de Pétri modifiée. À l’aide du micromanipulateur, placez la pointe de l’aiguille à moins de cinq millimètres de l’embryon supérieur, puis basculez l’aiguille d’avant en arrière pour se déplacer dans le plan où sa pointe apparaît la plus brillante dans l’image échographique.

À l’aide du micromanipulateur, poussez l’aiguille à travers la paroi utérine dans la cavité amniotique. Injectez 62 nanolitres de lentivirus avec la banque d’ARNsg à une vitesse d’injection lente. Appuyez huit fois sur le bouton Inject pour un total de 496 nanolitres par embryon.

Répétez la même procédure pour les deux autres embryons. Soulevez ensuite la tête d’échographie et retirez le bouchon en silicone. Poussez doucement les deux premiers des trois embryons dans l’abdomen de la souris à l’aide d’un coton-tige stérile.

Retirez les trois embryons suivants et enfoncez le troisième embryon précédemment injecté. Répétez la procédure d’injection jusqu’à ce que le nombre souhaité d’embryons soit injecté, en veillant à ne pas dépasser 30 minutes d’anesthésie. Lorsque vous avez terminé, soulevez la tête d’échographie, retirez le micromanipulateur avec l’aiguille, aspirez le PBS et retirez la boîte de Pétri.

À l’aide de lingettes stériles, absorbez tout PBS qui aurait pu s’accumuler dans la cavité abdominale. Fermez l’incision péritonéale à l’aide de sutures résorbables. Ensuite, utilisez deux agrafes pour fermer l’incision dans la peau abdominale.

Ensuite, les lectures de séquençage de génération de l’ADN amplifié par PCR à partir de cellules plasmides et de cellules transduites par banque lentivirale devraient montrer une forte corrélation. Si les lectures de l’ARNsg à partir de l’ADN plasmidique ne montrent pas une représentation égale des ARNsg, la procédure de préparation et de concentration virale doit être répétée avec précaution. Les résultats de l’injection guidée par ultrasons de lentivirus porteur de la Cre recombinase chez les bébés souris confettis E9.5 Lox-STOP-Lox au jour postnatal P0, sont présentés ici.

Bien qu’un titre élevé de virus entraînerait une plus grande couverture de la peau de la souris, il entraînerait également la transduction de plusieurs ARNsg dans la même cellule. Ce graphique montre les lectures de séquençage de nouvelle génération de l’ADN amplifié par PCR, à partir de cellules transduites par plasmide et de banque lentivirale, ainsi que les lectures de quatre tumeurs représentatives. Les guides d’ARNsg ciblant les suppresseurs de tumeurs ADAM10 et RIPK4 sont enrichis dans les échantillons tumoraux par rapport au pool plasmidique ou aux cellules infectées.

Il est essentiel d’effectuer la chirurgie à E9.5. N’oubliez pas de vérifier la grossesse par échographie, neuf jours après la mise en place du croisement et d’identifier le point temporel embryonnaire chez chaque souris femelle. Une fois les chiots nés, les cellules transduites peuvent être isolées et profilées de manière approfondie à l’aide des dernières techniques de profilage génétique telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire.