Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Ce protocole permet d’isoler des cellules progénitrices adipeuses de haute qualité à partir de tissu adipeux épididymaire de souris pour une analyse sensible en aval. Cette technique produit des cellules progénitrices adipeuses hautement viables et a été validée dans une récente étude de séquençage de l’ARN sur cellule unique. Après avoir euthanasié la souris mâle, localisez le coussinet adipeux de l’épididyme et tirez doucement dessus avec une pince émoussée pour le délibérer.

Utilisez des ciseaux pour retirer les testicules et incuber le coussinet adipeux épididymaire dans cinq millilitres de HBSS complété par 3 % BSA dans un tube conique de 50 millilitres pendant 15 minutes. Après l’incubation, centrifugez le tube à 150 x g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le coussinet adipeux épididymaire flottant du tube conique et hachez-le finement avec des ciseaux propres.

Ajoutez 200 millilitres de solution de collagénase à 2 % à 3,8 millilitres de HBSS dans un tube de culture de 13 millilitres. Ajoutez ensuite le tissu haché et incubez-le dans un incubateur rotatif à cinq tr/min pendant une heure à 37 degrés Celsius. Transférez tout le contenu dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de milieu de neutralisation.

Mélangez doucement en retournant le tube deux à trois fois. Préparez un autre tube conique de 50 millilitres équipé d’une crépine de 70 micromètres et filtrez le tissu digéré dans le nouveau tube. Transférez le débit dans un tube de 15 millilitres et des centrifugeuses à 350 x g par 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec cinq millilitres de DPBS. Ensuite, centrifugez le tube pendant encore 10 minutes. Retirez délicatement le surnageant et ajoutez 50 microlitres de tampon de cytométrie en flux.

Mélangez les cellules en pipetant doucement et maintenez-les sur de la glace. Le volume total des cellules dans le tampon de cytométrie en flux sera d’environ 100 microlitres. Après avoir mélangé les cellules, transférez 54 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre.

Ajoutez six microlitres de réactif de blocage FCR et pipetez doucement pour mélanger. Ensuite, incubez le tube à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Conservez les cellules restantes sur de la glace pour les utiliser comme contrôle non taché.

Pendant l’incubation, préparez un cocktail d’anticorps en combinant 11 microlitres chacun d’anticorps anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC et anti-CD45-FITC dans un tube de microcentrifugation. Pipetez doucement le mélange et conservez-le sur de la glace à l’abri de la lumière. Après l’incubation avec le réactif bloquant le FCR, ajoutez 40 microlitres du cocktail d’anticorps et mélangez bien avec un pipetage doux.

Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Ajoutez 500 microlitres de tampon de cytométrie en flux complété par un microgramme par millilitre de DAPI dans les cellules de coloration. Mélangez bien et filtrez les cellules à l’aide d’un tube à essai de cinq millilitres avec un capuchon à pression de crépine de cellule.

Gardez ensuite les cellules sur de la glace. Ajoutez 500 microlitres de tampon de cytométrie en flux aux cellules non colorées et mélangez en pipetant doucement. Utilisez un tube à essai de cinq millilitres avec un capuchon à pression pour filtrer les cellules et les maintenir sur de la glace.

Transportez les cellules colorées et le contrôle non coloré vers l’instrument d’analyse ou de tri FACS. Identifiez et isolez la population APC positive, FITC négative et DAPI négative à l’aide des stratégies de contrôle décrites dans le manuscrit du texte. Utilisez les commandes non colorées pour faciliter le réglage des paramètres de déclenchement.

Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC-SSC, les cellules viables ont été contrôlées, suivies de la sélection de la population APC-positive et FITC négative. Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées sur la base du contrôle non coloré. Les résultats suivants montrent l’isolement de cellules progénitrices adipeuses chez des souris FVB mâles âgées de quatre mois.

Après une heure de tri, la qualité de l’isolement a été évaluée quantitativement par une analyse par cytométrie en flux, qui a démontré que les cellules maintenaient une viabilité et une pureté élevées. Des analyses sensibles en aval peuvent être effectuées après ce protocole, telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique, la PCR quantitative en temps réel et la cytométrie en flux. Cela permettra une caractérisation plus poussée des cellules progénitrices adipeuses.

Les cellules progénitrices adipeuses sont des populations hétérogènes qui nécessitent d’autres études sur cellule unique. Cette méthode permet d’isoler les cellules adaptées aux études sur cellule unique.