Name: Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Apprenez à isoler des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaires de souris par tri cellulaire assisté par fluorescence. Cette méthode offre une haute viabilité et pureté pour l'analyse ARN séquençage cellulaire unique.

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Nous reconnaissons l’installation de cytométrie de flux de base d’analyse cellulaire de microscopie de la Clinique Mayo pour l’aide au tri facs.

Toutes les procédures expérimentales pour animaux ont été effectuées sous approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo.
1. Préparation de la solution 
<ol><li>Préparer la solution collagène 2% (w/v) en dissolvant la collagène II 2 g dans la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks de 100 mL. Aliquot 200 μL chacun pour chaque utilisation.</li>
	<li>Préparer le milieu de neutralisation en mélangeant 84 mL de sérum de cheval F-12, 15 mL de sérum de cheval et 1 mL de pénicilline/streptomycine.</li>
	<li>Préparez le tampon de cytométrie d’écoulement en dissolvant 500 mg d’albumine bovine de sérum (BSA) et 400 μL de 0,5 M EDTA dans 100 mL de saline phosphate-tamponnée de Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>2. Dissection de la garniture épididymale de graisse et de la dissociation de tissu
<ol><li>Euthanasier humainement (isoflurane/dislocation cervicale) une souris mâle. Dans ce protocole, une souris FVB de quatre mois a été utilisée.</li>
	<li>Appliquer/pulvériser 70% d’éthanol sur l’abdomen et exposer la cavité abdominale inférieure à l’aide de ciseaux et de forceps propres.</li>
	<li>Localiser la garniture épididymale de graisse (proximale/attachée aux testicules). Maintenez la jonction entre les testicules et la garniture épididymale de graisse avec des forceps émoussés et tirez doucement pour libérer le tampon épididymal de graisse.</li>
	<li>Retirer les testicules en coupant à l’aide de ciseaux et incuber la garniture épididymale de graisse dans 5 mL de HBSS complété avec 3% de BSA dans un tube conique de 50 mL à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Centrifugeuse à 150 x g pendant 7 min à 4 °C.</li>
	<li>Prenez la garniture épididymale flottante de graisse du tube conique de 50 mL et hachez finement le tissu utilisant les ciseaux propres.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de collagène 2% solution dans 3,8 mL de HBSS dans un tube de culture de 13 mL. Ajouter le tissu haché et incuber dans un incubateur rotatif à 5 rpm pendant 1 h à 37 °C. Au lieu d’un incubateur rotatif, incubateur de culture cellulaire à 37 °C peut être alternativement utilisé avec des agitations occasionnelles.</li>
	<li>Transférer le contenu entier dans un tube conique de 50 mL et ajouter 10 mL de milieu de neutralisation. Mélanger délicatement en inversant le tube 2-3 fois.</li>
	<li>Préparer un autre tube conique de 50 mL équipé d’une passoire cellulaire de 70 μm. Filtrer le tissu digéré dans le nouveau tube à l’aide de la passoire cellulaire.</li>
	<li>Transférer le débit dans un tube conique de 15 mL et une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez soigneusement les granulés de cellules supernatants et résuspendants avec 5 mL de DPBS. Centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 50 μL de tampon de cytométrie d’écoulement. Bien mélanger en pipetting doucement et garder les cellules sur la glace. En raison du volume des granulés cellulaires et de la petite quantité de supernatant résiduel, le volume total des cellules dans le tampon de cytométrie de flux sera supérieur à 50 μL (environ 100 μL).</li>
</ol>3. Étiquetage des anticorps et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
<ol><li>Après avoir bien mélangé les cellules avec un tuyautage doux, transférer 54 μL de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL. Ajouter 6 μL de réhésif de blocage FcR et bien mélanger en pipetting doucement. Incuber à 4 °C pendant 10 min. Enregistrez les cellules qui restent après avoir pris 54 μL et gardez-les dans la glace pour les utiliser comme un contrôle non taché à l’étape 3.5 et à l’étape 3.6.</li>
	<li>Pendant l’incubation à l’étape 3.1, préparer un cocktail d’anticorps en combinant 11 μL chacun d’anticorps anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC et anticorps anti-CD45-FITC dans un tube de microcentrifugeuse. Bien mélanger par pipetting doux et garder sur la glace à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Après incubation avec le reagent de blocage FcR pendant 10 min, ajouter 40 μL du cocktail d’anticorps et bien mélanger par pipetting doux. Incuber à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement complété par 1 μg/mL de DAPI dans les cellules tachées. Bien mélanger en utilisant un tube à essai de 5 mL avec un bouchon de pression de passoire cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement aux cellules restantes à l’étape 3.1 et bien mélanger par pipetting doux. Filtrer les cellules à l’aide d’un tube à essai de 5 mL avec bouchon de pression de passoire cellulaire. Gardez ces cellules sur la glace et utilisez-les comme un contrôle non taché dans l’étape suivante.</li>
	<li>Prenez les cellules tachées et le contrôle non taché à l’instrument d’analyse ou de tri facs.<ol>
<li>Identifier et isoler l’APC+/FITC-/DAPI- population avec des stratégies de gating indiquées dans la figure 1. Ces cellules représentent viables Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- cellules. Les débris et les agrégats cellulaires sont épuisés à l’aide de parcelles avant (FSC) et latérales de dispersion (SSC). Ensuite, DAPI- la population est fermée, suivie d’un gating d’APC+/FITC- population. Les commandes non tachées doivent être utilisées pour aider à définir les paramètres de gating.</li>
		<li>Recueillir les cellules dans 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. À l’avenir, toutes les procédures devraient être effectuées dans des conditions stériles afin de minimiser une contamination. Environ 50 000 à 100 000 cellules sont collectées à partir d’une souris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour évaluer la viabilité des cellules. Étant donné que les agrégats cellulaires peuvent interférer avec d’autres analyses en aval, la présence d’agrégats cellulaires est également évaluée afin d’assurer une présence minimale (et non 5 % du nombre de cellules viables) de ces agrégats.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le séquençage à ARN à cellules simples (scRNA-seq) gagne rapidement du terrain en tant qu’outil puissant pour étudier simultanément diverses populations cellulaires au niveau d’une seule cellule. En raison des coûts élevés associés à la préparation de l’échantillon et au séquençage à haut débit, il est impératif d’optimiser les intrants cellulaires (grande viabilité et pureté) afin d’augmenter les chances de succès expérimental. Certains protocoles de préparation cellulaire reposent sur l’enlèvement des cellules mortes e...

Le tissu adipeux joue un rôle clé dans le métabolisme énergétique. L’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides, et le tissu adipeux est capable d’expansion ou de rétractation significative en fonction de l’état nutritionnel et de la demande énergétique. L’expansion du tissu adipeux peut résulter d’une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et/ou d’une augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie); ce dernier processus étroitement régulé par la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices adipeuses1,2. Pendant l’obésité, le tissu adipeux se dilate excessivement, et le dysfonctionnement de tissu - y compris l’hypoxie, l’inflammation, et la résistance à l’insuline -développe souvent 3,4. Ces complications sont des facteurs de risque de nombreuses maladies chroniques, y compris l’hypertension, le diabète, les maladies cardiovasculaires, les accidents vasculaires cérébraux et le cancer5. Par conséquent, la limitation de l’expansion incontrôlée des tissus adipeux et l’atténuation des pathologies tissulaires adipeux sont les principales priorités de recherche biomédicale. Au cours de l’expansion des tissus adipeux, les cellules souches adipeuses résidentes dérivées des tissus prolifèrent et se différencient séquentiellement en préadipocytes (cellules progénitrices engagées) puis en adipocytes matures6. Des études récentes sur le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) montrent que ces populations de cellules progénitrices adipeux (APC) (ASC et préadipocytes) présentent une hétérogénéité moléculaire et fonctionnellesubstantielle 7,8,9,10,11,12. Par exemple, les ASC affichent une capacité de différenciation adpogénique réduite, tout en présentant des capacités de prolifération et d’expansion plus élevées, par rapport aux préadipocytes7. D’autres différences moléculaires sont rapportées au sein des populations de NC et de préadipocytes, bien que la pertinence fonctionnelle de ces différences restepeu claire 7. Ensemble, ces données mettent en évidence la complexité du pool de cellules progénitrices adipeux et soulignent la nécessité de mettre au point et de normaliser des outils pour mieux comprendre et manipuler ces populations cellulaires critiques.
Ce protocole détaille l’isolement des populations de cellules progénitrices épididymales à haute viabilité Sca1+ adipose provenant de tampons graisseux épididymaux de souris qui conviennent aux analyses sensibles en aval, y compris les études à cellules simples (scRNA-séquençage) et la culture cellulaire. L’isolement et la dissociation des garnitures épididymales de graisse ont été exécutéscomme précédemment décrit 7,13 avec de légères modifications qui améliorent la viabilité des APC isolés. En bref, les cellules dissociées des adipeuses épididymales sont tachées d’anticorps contre Sca1, un marqueur pour les ASC et les préadipocytes6,7, et d’autres marqueurs de lignée (Lin) : Ter119 (cellules érythroïdes), CD31 (cellules endothéliales) et CD45 (leucocytes). Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- les cellules sont ensuite triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Fait important, ce protocole a été validé par l’isolement et l’analyse réussis des cellules progénitrices viables de Sca1++/Lin- adipeuses rapportées dans une étude récente de séquençage d’ARN unicellulaire qui a identifié des sous-populations fonctionnellement hétérogènes dans les ASCs et les préadipocytes7.

<table><tbody><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tube de culture de 13 mL Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Tube à essai de 5 mL avec filtre à cellules</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 et micro ; Filtre à cellules m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD31-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Sca1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ter119-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Réactif bloquant FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’iodure de propidium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Tél. : 130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

L’obésité et les désordres métaboliques tels que le diabète, la maladie cardiaque, et le cancer, sont tous associés au remodelage adipeux dramatique de tissu. Les cellules progénitrices adipeuses résidentes des tissus jouent un rôle clé dans l’homéostasie des tissus adipeux et peuvent contribuer à la pathologie tissulaire. L’utilisation croissante de technologies d’analyse à cellules individuelles – y compris le séquençage de l’ARN unicell cellules et la protéomique à cellules individuelles – transforme le champ des cellules souches/progénitrices en permettant une résolution sans précédent des changements d’expression cellulaire individuelle dans le contexte des changements à l’échelle de la population ou des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour disséquer le tissu adipeux épididymal de souris, isoler les cellules dérivées de tissus adipeux simples, et effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir pour viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC. Ces protocoles permettront aux chercheurs de préparer des APC de haute qualité adaptés aux analyses en aval, comme le séquençage de l’ARN à cellule unique.

Des souris FVB mâles de quatre mois ont été employées dans cette expérience. Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC/SSC, des cellules viables (DAPI- population) ont été fermées, suivies de la sélection d’APC+/FITC- population (figure 1). Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées en fonction du contrôle non taché. Les stratégies de gating sont indiquées dans la figure 1.
<p class="jove_cont...

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Ce protocole permet d’isoler des cellules progénitrices adipeuses de haute qualité à partir de tissu adipeux épididymaire de souris pour une analyse sensible en aval. Cette technique produit des cellules progénitrices adipeuses hautement viables et a été validée dans une récente étude de séquençage de l’ARN sur cellule unique. Après avoir euthanasié la souris mâle, localisez le coussinet adipeux de l’épididyme et tirez doucement dessus avec une pince émoussée pour le délibérer.Utilisez des ciseaux pour retirer les testicules et incuber le coussinet adipeux épididymaire dans cinq millilitres de HBSS complété par 3 % BSA dans un tube conique de 50 millilitres pendant 15 minutes. Après l’incubation, centrifugez le tube à 150 x g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le coussinet adipeux épididymaire flottant du tube conique et hachez-le finement avec des ciseaux propres.Ajoutez 200 millilitres de solution de collagénase à 2 % à 3,8 millilitres de HBSS dans un tube de culture de 13 millilitres. Ajoutez ensuite le tissu haché et incubez-le dans un incubateur rotatif à cinq tr/min pendant une heure à 37 degrés Celsius. Transférez tout le contenu dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de milieu de neutralisation.Mélangez doucement en retournant le tube deux à trois fois. Préparez un autre tube conique de 50 millilitres équipé d’une crépine de 70 micromètres et filtrez le tissu digéré dans le nouveau tube. Transférez le débit dans un tube de 15 millilitres et des centrifugeuses à 350 x g par 10 minutes à quatre degrés Celsius.Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec cinq millilitres de DPBS. Ensuite, centrifugez le tube pendant encore 10 minutes. Retirez délicatement le surnageant et ajoutez 50 microlitres de tampon de cytométrie en flux.Mélangez les cellules en pipetant doucement et maintenez-les sur de la glace. Le volume total des cellules dans le tampon de cytométrie en flux sera d’environ 100 microlitres. Après avoir mélangé les cellules, transférez 54 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre.Ajoutez six microlitres de réactif de blocage FCR et pipetez doucement pour mélanger. Ensuite, incubez le tube à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Conservez les cellules restantes sur de la glace pour les utiliser comme contrôle non taché.Pendant l’incubation, préparez un cocktail d’anticorps en combinant 11 microlitres chacun d’anticorps anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC et anti-CD45-FITC dans un tube de microcentrifugation. Pipetez doucement le mélange et conservez-le sur de la glace à l’abri de la lumière. Après l’incubation avec le réactif bloquant le FCR, ajoutez 40 microlitres du cocktail d’anticorps et mélangez bien avec un pipetage doux.Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Ajoutez 500 microlitres de tampon de cytométrie en flux complété par un microgramme par millilitre de DAPI dans les cellules de coloration. Mélangez bien et filtrez les cellules à l’aide d’un tube à essai de cinq millilitres avec un capuchon à pression de crépine de cellule.Gardez ensuite les cellules sur de la glace. Ajoutez 500 microlitres de tampon de cytométrie en flux aux cellules non colorées et mélangez en pipetant doucement. Utilisez un tube à essai de cinq millilitres avec un capuchon à pression pour filtrer les cellules et les maintenir sur de la glace.Transportez les cellules colorées et le contrôle non coloré vers l’instrument d’analyse ou de tri FACS. Identifiez et isolez la population APC positive, FITC négative et DAPI négative à l’aide des stratégies de contrôle décrites dans le manuscrit du texte. Utilisez les commandes non colorées pour faciliter le réglage des paramètres de déclenchement.Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC-SSC, les cellules viables ont été contrôlées, suivies de la sélection de la population APC-positive et FITC négative. Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées sur la base du contrôle non coloré. Les résultats suivants montrent l’isolement de cellules progénitrices adipeuses chez des souris FVB mâles âgées de quatre mois.Après une heure de tri, la qualité de l’isolement a été évaluée quantitativement par une analyse par cytométrie en flux, qui a démontré que les cellules maintenaient une viabilité et une pureté élevées. Des analyses sensibles en aval peuvent être effectuées après ce protocole, telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique, la PCR quantitative en temps réel et la cytométrie en flux. Cela permettra une caractérisation plus poussée des cellules progénitrices adipeuses.Les cellules progénitrices adipeuses sont des populations hétérogènes qui nécessitent d’autres études sur cellule unique. Cette méthode permet d’isoler les cellules adaptées aux études sur cellule unique.

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Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules souches dérivées du tissu adipeux de l’arc périaortique murin marquées par fluorescence à partir de tissus adipeux murins de l’arc périaortique. Après l’isolement, les NCADCs sont détectés, triés à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence, puis cultivés sur une plaque, favorisant ainsi la prolifération cellulaire.

Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux périortique murin

Nous rapportons ici une méthode pour l'isolement des populations de cellules progénitrices d'adipocytes (APC) à partir du tissu adipeux périvasculaire (PVAT) en utilisant le triage cellulaire activé par magnétisation (MCS). Cette méthode permet une augmentation de l'isolement de l'APC par gramme de tissu adipeux par rapport au tri de cellules activées par fluorescence (FACS).

Expansion et adipogénèse Induction de progéniteurs d&#39;adipocytes à partir de tissus adipeux périvasculaires isolés par tri magnétique de cellules activées

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

Les préadipocytes sont isolés de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées et différenciés en cellules qui accumulent des gouttelettes lipidiques, expriment des marqueurs moléculaires et montrent la morphologie mitochondriale des adipocytes bruns matures. Ces cellules sont analysées par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission.

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

Le tissu adipeux est une excellente source de cellules souches mésenchymateuses. Ici, nous apportons étape par étape l’extraction, la culture et la caractérisation de cellules souches dérivées du tissu adipeux adipeux (ADSC) à partir de tissu adipeux épididymaire de souris suisses.

Isolement, expansion in vitro et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux épididymaire de souris

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence...

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Apprenez à isoler des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaires de souris par tri cellulaire assisté par fluorescence. Cette méthode offre une haute viabilité et pureté pour l'analyse ARN séquençage cellulaire unique.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

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