Name: Analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Découvrez les techniques de papier buvard et de pot contaminé pour analyser la pourriture des racines sèches chez le pois chiche. Ces méthodes permettent d'étudier les interactions avec Rhizoctonia bataticola et de sélectionner des génotypes résistants.

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Les projets du laboratoire M.S.K sont appuyés par le financement de base du National Institute of Plant Genome Research. VI reconnaît DBT- FRJ (DBT/2015/NIPGR/430). Nous remercions les étudiants stagiaires, Mlle Rishika, M. Jayachendrayan et Mlle Durgadevi pour leur aide technique pendant le tournage vidéo, ainsi que M. Sandeep Dixit, Mlle Anjali et le Dr Avanish Rai pour avoir évalué de façon critique les données brutes et les fichiers manuscrits. Nous remercions M. Rahim H Tarafdar et M. Sunder Solanki pour leur aide dans le laboratoire. Nous reconnaissons le DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) et la Bibliothèque NIPGR pour avoir fourni l’accès aux ressources électroniques et à l’installation de croissance des plantes NIPGR pour le soutien et l’espace de croissance des plantes.

1. Isolement de R. bataticola et stockage
<ol><li>Détails du génotype de pois chiches et des symptômes du DRR<ol>
<li>Utilisez des plants de pois chiches (génotype, JG 62) qui présentent généralement des symptômes typiques de DRR, tels que la racine primaire sèche et cassante sans racines latérales et microscléotie sous l’écorce et à l’intérieur du pith1,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collecte et lavage<ol>
<li>Plantes déracinées présentant des symptômes tels que le foliar sec de couleur paille et la racine primaire cassante avec microscléotie sous la couche épiderme. Pendant le déracinement, une grande partie des racines resteront à l’intérieur du sol car les racines infectées sont cassantes. Enlever les débris grossiers du sol attachés à la racine. Coupez les racines séparément et recueillez-les dans des enveloppes en papier (27,5 cm x 12 cm) avec l’étiquette appropriée et placez-les dans une boîte de collecte d’échantillons.</li>
		<li>Après avoir transporté des échantillons au laboratoire, placez les racines dans un bécher de 200 mL et couvrez-les de maille (maille en nylon de la taille du pore de 3 mm de diamètre) et lavez soigneusement les racines avec de l’eau courante du robinet pour éliminer les particules de sol adhérentes.</li>
		<li>Utilisez de l’eau d’osmose inverse (RO) pour rincer une fois à la fin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stérilisation de surface<ol>
<li>Casser les racines en quatre morceaux de 2 cm de longueur chacun avec une lame de scalpel et les mettre dans un bécher propre de 200 mL.</li>
		<li>Assemblez de l’eau RO autoclavée, 2 % de NaOCl, un bocal de rejet et du papier buvard autoclavé (5 cm2)à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire.</li>
		<li>Laver les racines avec 50 mL d’eau RO autoclavée trois fois, puis avec 50 mL de 2% de NaOCl pendant 10 min. Lavez les racines avec 50 mL d’eau RO trois fois de plus pour enlever le NaOCl.</li>
		<li>Éponger les racines en plaçant les racines sur du papier buvard autoclavé et laisser jusqu’à ce que les racines soient séchées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Médias et incubation<ol>
<li>Retirer les bords des racines à l’l’arme d’une lame de scalpel stérilisée. Fendre les racines à l’aide de la lame et utiliser les forceps stérilisés pour les placer sur une plaque petri de dextrose de pomme de terre (PDA) contenant du sulfate de streptomicine (50 mg L-1)et de l’ampicilline (50 mg L-1).</li>
		<li>Fermez la plaque, scellez avec du parafilm et incubez dans un incubateur à 28 °C pendant deux jours dans l’obscurité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Méthode de pointe hyphal<ol>
<li>Après deux jours d’incubation, apportez les plaques dans la chambre d’écoulement laminaire. Couper la pointe de la croissance hyphale8 sous un stéréomicroscope (Stéréomicroscope éducatif Leica EZ4) et le transférer dans une plaque PDA fraîche avec du sulfate de streptomie et de l’ampicilline.</li>
		<li>Incuber les assiettes dans l’incubateur à 28 °C pendant dix jours dans l’obscurité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stockage et entretien de l’inoculum fongique R. bataticola<ol>
<li>Faites des obliques PDA dans des tubes à essai et transférez un bouchon d’agar fongique à partir d’une plaque de culture vieille de dix jours à l’aide de la boucle d’inoculation stérilisée par la flamme. Sceller le bouchon du tube à essai avec du parafilm.</li>
		<li>Incuber les inclinaisons à 28 °C pendant dix jours dans l’obscurité.</li>
		<li>Sceller à nouveau le bouchon avec du parafilm et le conserver à 4 °C au réfrigérateur pour l’utilisation future.</li>
		<li>Sous-culture tous les six mois pour maintenir le champignon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maintien de la virulence<ol>
<li>Infecter les plantes avec l’inoculum fongique pur préparé comme mentionné dans la technique de pot malade3. Isoler le même champignon des plantes infectées (postulats de Koch)9 et l’utiliser pour d’autres expériences. REMARQUE : Dans cette étude, une souche isolée sur le terrain du champignon a été utilisée (GenBank : MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Technique de papier blotting
REMARQUE : La technique du papier buvard implique la préparation de l’inoculum fongique liquide, la préparation des semis et l’évaluation de la maladie.
<ol><li>Préparation du liquide R. bataticola inoculum REMARQUE : L’inoculum fongique liquide R. bataticola contient à la fois du mycélia et de la microscléotie. Ces deux structures agissent comme inoculum primaire.<ol>
<li>Préparez 500 mL de supports PDB dans un flacon de 1 000 mL et autoclavez-le à 121 lb pendant 15 min.</li>
		<li>Une fois les supports refroidis, inoculer le bouillon avec une boucle de bouchon d’agar fongique d’une culture fongique oblique et incuber à 28 °C pendant cinq jours dans un shaker à 180 rpm dans l’obscurité.</li>
		<li>Assembler un entonnoir en verre ou en plastique autoclavé (10 cm), un flacon conique d’un litre et deux couches de maille (taille de 10 cm2) (maille en nylon avec la taille du pore de 3 mm de diamètre) sur la table. Filtrer les mycélia fongiques et la microscléotie à l’aide du maillage. Éponger le champignon dans du papier buvard autoclavé.</li>
		<li>Pesez 100 g de mycélie pour 50% d’inoculum et maintenez à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la plante de pois chiches<ol>
<li>Sélectionnez 50 graines saines (dans cette étude, le génotype sensible au DRR JG 62 a été utilisé), placez-les dans un bécher de 100 mL et couvrez-les d’un maillage.</li>
		<li>Lavez d’abord les graines avec de l’eau du robinet pour enlever les débris du sol.</li>
		<li>Prendre le bécher avec des graines dans la chambre d’écoulement laminaire et les laver avec stérilisé 50 mL d’eau RO trois fois pendant 1 min par lavage.</li>
		<li>Stériliser les graines avec 50 mL de NaOCl 2% aqueux pendant 2 min avec des secousses continues et laver les graines avec 50 mL d’eau stérilisée cinq fois pendant 1 min chacune.</li>
		<li>Remplir un sac en polyéthène (47,5 cm x 25 cm) de Soilrite (un mélange de perlite élargie de qualité horticole, de mousse de tourbe irlandaise et de vermiculite exfoliée à rapport égal, c’est-à-dire 1/3:1/3:1/3), semer la surface stérilisée 50 graines de deux cm de profondeur, et garder dans une chambre de croissance / pièce avec 28 °C ± 2 °C température, 16 h photopériod avec une intensité lumineuse de 150 μmol m−2 s−1, et l’humidité relative de 70%. Arrosez-les avec de l’eau RO et déraciner les plantes huit jours après le semis.</li>
		<li>Laver les racines dans l’eau du robinet pour enlever les particules soilrite. Rincez les racines à l’eau RO stérilisée et gardez-les dans l’eau RO dans un bécher de 1000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de papier buvard dans des plateaux<ol>
<li>Prenez un papier buvard et coupez-les en morceaux (30 cm × 23 cm) en nombre suffisant pour répondre aux réplications.</li>
		<li>Emballez les feuilles dans un sac en polyéthène autoclavable et autoclavez-les à 121 lb pendant 15 minutes et gardez-les dans un four à air chaud pour le séchage.</li>
		<li>Plier chaque feuille de papier buvard en deux.</li>
		<li>Placez le papier sur un plateau en plastique propre et essuyé par l’esprit, comme le montre la figure 2i-iv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculation des plantes par trempage<ol>
<li>Dissoudre 100 g d’inoculum fongique dans 200 mL d’eau RO autoclavée dans un bécher de 200 mL pour obtenir 50% d’inoculum.</li>
		<li>Tremper les racines des plantes dans l’inoculum préparé pendant 1 min avec un mouvement intermittent de haut en bas pour assurer un attachement uniforme à l’inoculum fongique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les plantes dans le papier buvard<ol>
<li>Mouiller le côté inférieur du papier buvard placé sur le plateau avec de l’eau RO stérile. Placez les plantes sur le papier d’une manière où seules les racines sont couvertes par le papier, et les pousses sont laissées de côté.</li>
		<li>Fermez-le en pliant le côté supérieur du papier buvard et mouiller tout le papier pour fournir suffisamment d’eau pour soutenir la croissance des plantes.</li>
		<li>Arrosez le plateau une fois par jour et gardez les plateaux à 28 °C. Observez quotidiennement les symptômes tels que la nécrose, la pourriture des racines et le jaunissement des feuilles.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Technique de pot malade
NOTE : La technique de pot malade implique la préparation de l’inoculum virulent et d’un pot malade, le maintien du niveau d’humidité, et l’évaluation des symptômes de la maladie.
<ol><li>Préparation du substrat<ol>
<li>Prenez un kg de graines de pois chiches disponibles dans le commerce. Enlever les graines infectées (graines dont la croissance fongique est fongique, les taches d’infection et les dommages causés par les insectes). Placez-les dans un bécher en plastique de 5 L et lavez-les à l’eau du robinet 3 à 4 fois pour enlever les débris majeurs.</li>
		<li>Laver les graines avec 2 L d’eau RO trois fois et faire tremper les graines de 1 kg dans un bécher de 5 L avec trois fois plus d’eau pendant cinq heures.</li>
		<li>Une fois que les graines ont imbibé l’eau, la relivez-les avec de l’eau RO trois fois pour enlever les exsudats de graines.</li>
		<li>Retirer complètement l’eau et emballer les graines dans des bouteilles de confiture (300 mL, 12 cm de hauteur, 6 cm de diamètre et 155 g de poids) à environ 1/4de capacité (100 g par bouteille de confiture) et fermer les bouteilles avec des bouchons. Emballez dix bouteilles de confiture dans un sac en plastique autoclavable (48 cm x 30 cm) autoclave deux fois à 121 lb pendant 15 min en continu.</li>
		<li>Sécher les graines à 40 °C au four toute la nuit pour enlever les gouttelettes d’eau à l’intérieur de la bouteille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la culture malade<ol>
<li>Allumez la chambre d’écoulement laminaire de niveau BSL-2. Essuyer le plancher à fond avec 70% d’éthanol, et allumer les UV pendant 15 min. Ensuite, gardez les graines à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire.</li>
		<li>Prenez la culture R. bataticola fraîchement isolée de 10 jours (partie 1). Ensuite, prenez trois bouchons d’agar fongiques (diamètre de 4 mm) à l’aide d’une pointe stérile pipette ou de l’agrile du liège, et mettez-les dans des bouteilles de confiture aseptiques. Couvrir les bouteilles de bouchons et sceller avec du parafilm.</li>
		<li>Agiter les bouteilles pour mélanger uniformément le disque fongique avec les graines de pois chiches.</li>
		<li>Incuber les bouteilles à 30 °C pendant 15 jours dans l’obscurité.</li>
		<li>Prenez des bouteilles de confiture avec la croissance fongique noire (figure 4iii) et transférez la culture malade (graines avec la microscléotie) des bouteilles de confiture à une plaque en verre de Petri utilisant des forceps stériles. Séchez-les à température ambiante pendant deux jours dans une assiette de Pétri en verre.</li>
		<li>Poudrer la masse fongique à l’aide d’un mortier et d’un pilon, et conserver la poudre à 4 °C.</li>
		<li>Autoclave Soilrite deux fois à 121 lbs pendant 15 min.</li>
		<li>Séchez le mélange de Soilrite autoclaved sous un parasol.</li>
		<li>Mélanger la poudre fongique avec soilrite à 50% w/w, remplir les pots avec le mélange, et les garder à température ambiante pendant une journée.</li>
		<li>Semer une graine de pois chiches sensible à la DRR stérilisée de surface par pot (pots ronds de 10 cm)(tableau des matériaux)et maintenir un niveau d’humidité de 80 % de la capacité de champ (FC).</li>
		<li>Observez les symptômes tels que la nécrose et la pourriture des racines en déracinant les plantes après la germination.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Évaluation de l’efficacité des pots malades REMARQUE : Les plantes présentent des symptômes fœlaux jaunes lorsque les racines sont complètement pourries.<ol>
<li>Développer un score de maladie basé sur les nombres de lésions (taches nécrotiques)(figure supplémentaire 2C)et la gravité de la pourriture des racines. Les pots malades montrant 90% de mortalité végétale peuvent être utilisés plus loin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dépistage du génotype<ol>
<li>Préparer la culture malade en grande quantité et la mélanger soit avec du soilrite stérilisé, soit du sol de champ (5 % w/w) dans des pots de 30 cm de haut. Arrosez les pots pour mouiller la surface et laissez-les intacts pendant sept jours.</li>
		<li>Semer une graine stérilisée de surface par pot rond de 10 cm et trois graines par pot rond de 30 cm et les arroser adéquatement.</li>
		<li>Observez les symptômes jaunes de pourriture fœliar et de racine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sécheresse combinée et infection à R. bataticola<ol>
<li>Imposer le stress dû à la sécheresse en suivant les protocoles mentionnés dans Sinha et coll. (2019).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
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<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
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<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer

La technique du papier buvard offre une approche simple pour dépister les génotypes de pois chiches dans des conditions de laboratoire. L’inoculation dip permet l’étude de l’interaction sur une base temporelle avec un contrôle facile sur la charge inoculum (Figure supplémentaire 1) et facilite le dépistage in vitro. En outre, même les jeunes semis peuvent être utilisés. La culture fongique de cinq jours (figure 1B) peut produire suffisamment d’inoculum pour infecter les plan...

La pourriture sèche des racines (DRR) est l’une des maladies économiquement significatives chez les poischiches 1,2. Il s’agit d’une maladie spécifique aux racines causée par Rhizoctonia bataticola (télomorphe, Macrophomina phaseolina). Les plantes infectées n’ont pas de racines latérales et possèdent des taproots cassants et un feuillagejaune 1,3. DRR sous le stress de sécheresse a été rapporté pour être une menace émergente pour la culture de poischiches 1,2,3. En outre, l’incidence du DRR serait aggravée par le stress dû à la sécheresse sur leterrain 1,2,3. Le DRR est plus répandu dans les zones plu pleuvoir que dans les champs irrigués4. L’utilisation de variétés résistantes est le moyen de surmonter la maladie et de contourner l’utilisation de fongicides1,13. Étant donné que le germplasme de pois chiches disponible dans le monde entier abrite des variations génétiques pour le caractère5,le dépistage et l’identification des génotypes résistants/sensibles sont essentiels à la sélection moléculaire pour l’amélioration des cultures.
Des analyses robustes, faciles et rentables de la maladie sont essentielles pour étudier les modèles d’infection à R. bataticola chez les pois chiches. L’analyse primaire de la maladie utilisée pour observer la réponse des génotypes de pois chiches à l’infection à R. bataticola est la technique du papier buvard1,4. Il s’agit d’une technique simple qui peut être exécutée à l’aide d’inoculum fongique liquide, de semis aux racines et de papier buvard stérile. Cependant, cette technique n’a pas été utilisée à son maximum parce qu’aucun protocole étape par étape n’est disponible dans la littérature.
Pendant ce temps, la technique du pot malade implique la préparation d’une culture malade potentielle et l’imposition du stress dû à la sécheresse. Étant donné que le stress dû à la sécheresse aggrave l’incidence de la maladie de DRR3, il est essentiel d’étudier l’interaction plante-pathogène sous le stressdû à la sécheresse 6,7. La technique du pot malade fournit la plate-forme pour une telle étude simultanée, favorisant de meilleures possibilités pour le criblage de germplasme et comprenant la base mécaniste de l’interaction. Les changements pathomorphologiques tels qu’une augmentation de la longueur des racines et la réduction du nombre de racines latérales — inhérentes à la maladie du DRR — peuvent être abordés à l’aide de la technique du potmalade 1,3,7.
Dans ce cas, un protocole détaillé pour le papier buvard et les techniques de pot malade, qui peut être utilisé pour étudier l’interaction entre les pois chiches et R. bataticola et le germplasme de pois chiches, est présenté. Les détails des matériaux utilisés dans l’étude sont donnés dans le Tableau des matériaux.

<table><tbody><tr><td>Champignon - Rhizoctonia bataticola</td><td>Inoculum pathogène</td><td>Collection de culture de type indien n° 8365</td><td>GenBank : MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp ; id=1251&Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Soilrite</td><td>mix Milieu de sol en laboratoire</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, Inde</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Papier buvard pour soutenir la croissance des plantes</td><td>Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>Pot</td><td>Plantes en culture</td><td>Pots de 10 et 30 cm</td><td>Pots de pépinière couramment utilisés, par exemple, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Gélose / bouillon de dextrose de pomme de terre</td><td>Cultiver et entretenir le champignon</td><td>Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Incubateur Cultivez</td><td>le champignon</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubateur et agitateur</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Chambre de croissance</td><td>Plantes en culture dans des conditions contrôlées</td><td>Modèle n° A1000, Conviron, Canada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Flux d’air laminaire</td><td>Réalisation d’exercices aseptiques</td><td>Telstar, Bio II advance, Armoire de classe II, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Filtrer le mycélium fongique</td><td>Moustiquaire</td><td>en nylon Mesh avec des pores de 0,6 à 1 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Milieux d’autoclave et graines de pois chiches</td><td>Autoclave</td><td></td></tr><tr><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave Microscopes</td><td>Visualisation de l’infection et du mycélium fongique</td><td>SMZ25 / SMZ18, Stéréomicroscopes de recherche, Stéréomicroscope</td> <td>éducatif Leica EZ4https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Balance de pesage</td><td>Pesage de champignons et de produits chimiques</td><td>Balance électronique Sartorius, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Coloration fongique</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr><td>Bleu aniline</td><td>Coloration fongique</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

La maladie de la pourriture sèche des racines (DRR) est une menace émergente pour le stress biotique pour la culture des pois chiches dans le monde entier. Elle est causée par un pathogène fongique transmis par le sol, Rhizoctonia bataticola. Dans la littérature, les protocoles complets et détaillés étape par étape sur des analyses de maladie sont clairsemés. Cet article fournit des détails complets sur les étapes impliquées dans la mise en place d’une technique de papier buvard pour le dépistage rapide des génotypes pour la résistance à la DRR. La technique du papier buvard est facile et moins coûteuse. Une autre méthode, basée sur l’approche du pot malade, est un mimétisme de l’infection naturelle et peut être appliquée pour étudier les composants en interaction - plante, agent pathogène et environnement - impliqués dans le triangle de la maladie.
De plus, dans la nature, le DRR se produit principalement dans les zones de culture des pois chiches plu la pluie, où l’humidité du sol recule à mesure que la croissance des cultures progresse. Le stress dû à la sécheresse est connu pour prédisposer les plants de pois chiches à la maladie de DRR. La compréhension pathomorphologique et moléculaire de l’interaction plante-pathogène sous le stress dû à la sécheresse peut ouvrir la voie à l’identification de variétés d’élite résistantes au DRR à partir du bassin de germplasmes de pois chiches. Cet article fournit une méthodologie stepwise pour la préparation d’un pot malade et l’essai suivant de maladie. Dans l’ensemble, l’information présentée ci-après aidera les chercheurs à préparer l’inoculum fongique R. bataticola, à maintenir cet agent pathogène, à mettre en place la technique du papier buvard, à préparer la culture malade et le pot malade, et à évaluer l’infection pathogène chez les plantes de pois chiches.

Cette étude visait à démontrer des techniques telles que le papier buvard et les techniques de pot malade pour faciliter la compréhension pathomorphologique et moléculaire de l’interaction plante-pathogène sous le stress de la sécheresse. Pour ce faire, les plantes présentant des symptômes de DRR1,3,4 ont été recueillies dans un champ de pois chiches, et le champignon a été isolé en utilisant la méthode de pointe hyphale<sup cla...

Cette étude présente des méthodologies pour étudier les mécanismes pathomorphologiques et moléculaires sous-jacents à l’interaction entre le pois chiches etla rhizoctonia bataticola. La méthode du papier buvard est utile pour étudier rapidement les réponses du génotype de pois chiches, tandis que la méthode à base de pot malade peut être utilisée pour imposer simultanément la sécheresse et l’infection à R. bataticola et dépister les génotypes tolérants.

Analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

L’objectif principal de cette étude est de démontrer une méthodologie détaillée des analyses sèches de la maladie de pourriture des racines, telles que la technique du papier buvard et la technique du pot malade. Ces techniques seront utiles pour étudier l’interaction entre la plante de pois chiches et rhizoctonia bataticola. Comprendre l’interaction des plantes d’herbe à chiches avec l’agent pathogène fongique Rhizoctonia bataticola est d’importance agricole.Pour cela, des analyses polyvalentes et hautement reproductibles sont nécessaires. Ici, deux essais qui sont largement utilisés dans notre laboratoire sont démontrés. L’un d’eux est gonflé à base de papier, et l’autre est malade pot à base d’analyse.Pour exécuter l’analyse de papier buvard, préparer Rhizoctonia bataticola champignon inoculum en s’haussant de la culture oblique à la plaque Petri, puis à la culture liquide. Préparer la pépinière de pois chiches par, semer des graines dans une grande casserole. Déraciner et les mettre dans l’inoculum liquide et les placer sur du papier buvard.Observez les symptômes de la maladie, à savoir la nécrose sur la racine, la pourriture des racines et le jaunissement des feuilles huit jours après l’inoculation. Montré ici est un mot, les étapes dans la technique de papier buvard. Pour exécuter l’analyse de pot malade, inoculer le repas de pois chiches avec le champignon.Après incubation à 30 degrés Celsius pendant 15 jours, la culture malade est obtenue. Ensuite, poudrez-les et mélangez avec le mélange de pot. Semer des graines sur le pot de contrôle et le pot malade.Les jours suivants, observez les symptômes, à savoir la nécrose sur la racine, la pourriture des racines et le jaunissement des feuilles sur les plantes infectées, 10 jours après le semis. Le pot malade peut être mis à l’échelle et peut être utilisé pour des dépistages à grande échelle. Montré ici est un mot d’étapes dans la technique pot malade.Rhizoctonia bataticola est un pathogène en développement. Ce champignon produit de l’hyphae et de la microscléotie, qui agissent comme inuclum primaire pendant l’infection végétale. La culture pure qui s’applique par la méthode isolative est utilisée pour les analyses.Le point clé pour ces analyses réussies est la charge optimale d’inoculum. La démonstration de la technique du papier buvard commence ici. Pour préparer l’inoculum liquide rhizoctonia bataticola, inoculer le bouillon de 500 ml avec le bouchon d’agar fongique de trois jours de culture de plaques fraîches et incuber le flacon dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant cinq jours.Filtrer les mycélies fongiques gris foncé avec la microscléotie. Suspendre dans l’eau autoclavée et retirer les supports. Encore une fois, filtrer le mycélie et enlever l’humidité en séchant les mycélia pendant quelques minutes.Suspendre 100 grammes d’inoculum fongique dans 200 ml d’eau autoclavée dans une bouteille de confiture et mélanger correctement. Développer la pépinière de pois chiches en semant des graines stérilisées de surface en solerant. Déraciner les plantes huit jours après le semis, les laver et les rincer à l’aide d’un RO autoclavé. Prenez un papier buvard et pliez-le une fois et placez-en la moitié sur le plateau.Faites-le mouiller avec de l’eau autoclavée. Prenez les plantes et plongez dans l’inoculum pendant 30 secondes avec des mouvements intermittents de haut en bas. Placez les plantes de manière à ce que les racines soient couvertes à l’intérieur de la feuille et que les fœlias restent à l’extérieur.Pliez l’autre moitié et pliez le papier. Pour le contrôle, tremper les plantes dans de l’eau autoclavée, garder les plateaux dans une chambre de croissance pendant huit jours. Résultats. Observez les symptômes tels que le jaunissement des feuilles, la pourriture des racines, la nécrose de la racine et la réduction du nombre latéral de racines.La démonstration de la technique du pot malade commence ici. Prenez un kilogramme de graines commerciales de pois chiches. Laver les graines avec de l’eau du robinet et laver à nouveau avec l’eau RO.Faire tremper les graines pendant cinq heures. Encore une fois, laver les graines avec de l’eau RO ajouter 300 grammes dans une bouteille de confiture. Autoclavez-les à 121 LVS pendant 15 minutes deux fois en continu.Après refroidissement, transférer la bouteille à travers le flux laminaire. Inoculer les bouteilles avec trois bouchons d’agar fongique d’environ quatre millimètres carrés et bien les secouer pour bien mélanger. Enveloppez les bouteilles et incubez-les dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant 15 jours.Observez pour les bouteilles avec la croissance mycéliale foncée autour des graines de pois chiches et enlevez les graines. Séchez-les à température ambiante et poudrez-les. Mélanger la poudre de rhizoctonia bataticola avec le solorite et les garder à température ambiante pendant cinq jours.La surface stérilise les graines GT62 et les sème à deux centimètres de profondeur. Résultats. Observez la mortalité de 90% dans le pot malade. 10 jours après le semis, observez les symptômes tels que la nécrose des racines et la réduction du nombre de racines latérales et du jaunâtrement des feuilles dans les jours suivants.Pot malade peut être préparé dans le sol du champ ainsi. Sécheresse et infection à rhizoctonia bataticola. Imposer le stress de sécheresse dans le pot malade en retenant l’eau.On y voit les plantes soumises à la lutte, à la sécheresse, à l’agent pathogène et à la sécheresse et au stress pathogène simultanés. Observez pour les symptômes, à savoir, plus de nécrose, pourriture des racines, et la réduction du nombre de racines latérales, et la longueur des racines dans le traitement combiné de stress par rapport au traitement pathogène seulement. Conclusions. La technique du papier blotting peut être effectuée dans des conditions in vitro.La technique du pot malade peut être exécutée dans des conditions In Vivo. Dans les ports malades, le stress abiotique, c’est-à-dire le stress dû à la sécheresse, peut être imposé avec l’infection pathogène. En utilisant ces techniques, on peut étudier le modèle d’infection pathogène.La plupart des changements physiologiques se produisent au cours de l’interaction pois chiches-Rhizoctonia bataticola, et aussi l’écran des génotypes de pois chiches pour la résistance. L’analyse de papier buvard est très utile pour générer des échantillons de qualité pour la microscopie et les études de biologie moléculaire. L’essai de pot malade, qui imite les conditions normales d’infection, est applicable pour le criblage du germplasme de pois chiches.

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