Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Les microscopes à fluorescence à feuillet de lumière basés sur une chambre d’échantillon sont conçus pour un contenu élevé plutôt que pour un débit élevé. Les tests d’imagerie en direct doivent donc être effectués de manière séquentielle et donc moins affectés par la variance ambiante. Notre support de toile d’araignée permet l’empilement et l’imagerie simultanée de plusieurs embryons, éliminant ainsi la variance ambiante et augmentant le débit.

Le montage d’embryons dans le support de toile d’araignée nécessite une certaine finesse. Une vidéo explicative est idéale pour illustrer la séquence des nombreux gestes de conduite courts. Pour l’étalonnage de la chambre d’échantillonnage du microscope à fluorescence à feuillet de lumière.

Tout d’abord, reliquez une aliquote d’agarose dans un mélangeur de chauffe-moteur sec à 80 degrés Celsius. Laissez l’agarose fondue refroidir à 35 degrés Celsius et transférez 50 microlitres d’agarose dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Mélangez 0,5 microlitre de solution de microsphères fluorescentes avec l’agarose à 1 400 tours par minute pendant une minute, et remplissez le trou oblong du support de toile d’araignée avec 10 microlitres du mélange de solution de microsphères fluorescentes d’agarose.

Aspirez autant d’agarose que possible jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine pellicule d’agarose et laissez l’agarose se solidifier pendant 30 à 60 secondes. Remplissez la chambre d’échantillonnage avec de l’eau du robinet autoclavée et insérez lentement le support de toile d’araignée dans la chambre d’échantillonnage. Déplacez le trou oblong devant l’objectif de détection et faites pivoter le support à 45 degrés par rapport aux axes d’éclairage et de détection.

Le support de toile d’araignée ne doit pas être visible dans le canal de transmission de la lumière. Passez au canal de fluorescence approprié et ajustez la puissance du laser et le temps d’exposition, de sorte que les microsphères fluorescentes fournissent un signal approprié. Spécifiez un volume de vue qui couvre complètement le film d’agarose maintenant orienté transversalement et calculez la résolution axiale maximale possible pour la combinaison respective de lentilles d’éclairage et de détection afin de définir l’espacement Z.

Ensuite, enregistrez un empilement Z de test tridimensionnel des microsphères fluorescentes et comparez les projections maximales X, Y et Z à la carte d’étalonnage. Si les microsphères apparaissent floues, floues et/ou déformées. Ajustez les positions des lentilles d’éclairage et/ou de détection.

Pour la déchorisation embryonnaire, ajoutez huit millilitres d’eau du robinet autoclavée dans les puits A1, A2, A3 et B3 d’une plaque de six puits par ligne. Ensuite, ajoutez sept millilitres d’eau du robinet autoclavée et un millilitre de solution d’hypochlorite de sodium dans les puits B1 et B2. Placez la première plaque sous un stéréomicroscope et insérez le premier embryon contenant une passoire cellulaire dans le puits A1.

Lavez les embryons en agitant doucement pendant 30 à 60 secondes, avant de déplacer la passoire dans le puits B1. Secouez vigoureusement la plaque pendant 30 secondes, avant de transférer la passoire dans le puits A2. Lavez les embryons pendant une minute sous une légère agitation et déplacez la passoire dans le puits B2 pour une secousse vigoureuse jusqu’à ce que la plupart des embryons soient complètement déchorionés.

Ensuite, transférez la passoire dans le puits A3 pour une minute de lavage doux, avant de stocker la passoire d’embryons déchorionnés dans le puits B3 jusqu’à ce que les embryons des autres lignées aient été traités comme démontré. Pour monter les embryons sur le support de toile d’araignée, reliquez une autre aliquote d’agarose comme démontré. Lorsque l’agarose a refroidi, placez le support de toile d’araignée sous le stéréomicroscope et ajoutez 10 microlitres d’agarose dans le trou oblong.

Utilisez la pointe de la pipette pour étaler l’agarose sur le trou oblong, avant d’aspirer autant d’agarose que possible jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine pellicule d’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, utilisez un pinceau pour cueillir soigneusement et transférer les embryons sur le film d’agarose. Disposez-les le long de l’axe long du trou oblong, avec leurs axes antéro-postérieur alignés avec l’axe long du trou oblong.

Pour stabiliser les embryons, pipetez soigneusement un à deux microlitres d’agarose dans l’espace entre les embryons et le film d’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, insérez lentement le support de toile d’araignée avec les embryons montés dans la chambre d’échantillonnage remplie de tampon d’image. Pour imager les embryons, vérifiez que le support de toile d’araignée est dans une position de 45 degrés par rapport aux axes d’éclairage et de détection et dans le canal de transmission lumineuse, déplacez l’embryon au centre du champ de vision.

Le support de toile d’araignée ne doit pas être visible. Ensuite, déplacez l’embryon avec l’étape de micro-traduction en Z jusqu’à ce que le plan médian de l’embryon chevauche le plan focal et que le contour apparaisse net. Sans passer au canal de fluorescence, déplacez l’embryon de 250 microns dans les deux sens pour spécifier le volume de vue.

Si l’imagerie dans plusieurs directions est nécessaire, faites pivoter l’embryon de manière appropriée, faites la mise au point sur l’embryon et spécifiez le volume de vue comme cela vient d’être démontré. Ensuite, répétez cette procédure pour tous les autres embryons montés. Lorsque le volume de vue a été spécifié pour tous les embryons, définissez le canal de fluorescence et les paramètres time-lapse et démarrez le processus d’imagerie.

Pour les essais qui durent plusieurs jours, envisagez de couvrir l’ouverture de la chambre d’échantillonnage au moins partiellement pour réduire l’évaporation. Une fois le test d’imagerie terminé, retirez soigneusement le support de toile d’araignée de la chambre d’échantillonnage et utilisez un petit pinceau pour détacher les embryons de la pellicule d’agarose et placer les embryons sur une lame de microscope correctement étiquetée. Placez la lame dans un plat de récupération pour l’incubation dans les conditions d’élevage standard appropriées.

À l’approche du moment de l’éclosion, vérifiez fréquemment les boîtes de récupération et transférez les larves écloses dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits. Remplissez les puits à moitié avec le milieu de croissance approprié, puis incubez les larves dans les conditions d’élevage standard appropriées. Lorsque les individus observés atteignent l’âge adulte, fournissez des partenaires d’accouplement appropriés et vérifiez la présence d’une progéniture après plusieurs jours.

Dans cette vidéo, on peut observer la dynamique du signal fluorescent de trois embryons dérivés de différentes lignées de drosophile transgéniques sur une période d’environ une journée. On s’attendait à un profil de fluorescence similaire, car toutes les lignées exprimaient l’EGFP localisé nucléaire sous le contrôle de promoteurs présumés omniprésents et constitutivement actifs. Cependant, les résultats comparatifs de l’imagerie en direct ont révélé de fortes différences spatio-temporelles dans les modèles d’expression qui n’étaient pas des effets secondaires dus à la variance ambiante.

Dans cette analyse de trois embryons de Tribolium porteurs du même transgène basé sur le ferraillage. Les résultats comparatifs d’imagerie en direct du processus de fermeture de la fenêtre de la séreuse pendant la gastrulation suggèrent que la deuxième sous-ligne fournit un signal global remarquablement plus fort que les deux autres sous-lignes. Comme l’indiquent ces données, le contexte génomique peut également avoir une forte influence sur le niveau d’expression des transgènes dans Tribolium.

Notre approche est bien adaptée à l’analyse des phénotypes knockdown et knock-out, car elle permet d’imager simultanément les embryons témoins de type sauvage. Notre protocole peut également être utilisé pour comparer la morphogenèse de deux espèces d’insectes ou plus. Et ainsi, obtenez des connaissances plus approfondies sur l’évolution du développement.