Mesure des distributions cAMP à 3 dimensions dans des cellules vivantes à l’aide de l’imagerie et de l’analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ)

Ce protocole est important car il fournit une méthode pour mesurer et visualiser les signaux FRET ou AMP cycliques en trois dimensions spatiales dans des cellules individuelles. Les distributions cycliques de l’AMP peuvent se produire axialement ou latéralement, et il est important d’acquérir des données d’image cycliques FRET en trois dimensions pour échantillonner ces distributions. Le jour de l’imagerie, les Tyrodes chauds amortissent à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau et montent une lamelle de couverture avec les cellules d’intérêt transfectées dans une chambre cellulaire.

Fixez le haut de la chambre à l’aide d’un joint de montage pour éviter les fuites et utilisez un essuie-glace délicat pour éliminer tout excès de fluide ou de cellules adhérentes du bas de la lamelle. Ajoutez 800 microlitres de tampon de travail et quatre microlitres de marqueur nucléaire de cinq millimolaires dans la chambre cellulaire et secouez doucement la chambre pendant cinq à 10 secondes. Couvrez ensuite la chambre cellulaire d’une feuille d’aluminium pour une incubation de 10 minutes à température ambiante.

Pour imager les cellules, sélectionnez l’objectif à immersion dans l’eau 60X sur un microscope confocal équipé d’un détecteur spectral et ajoutez une goutte d’eau à l’objectif. Placez la chambre de cellule chargée sur la platine du microscope et réglez le bouton de filtre pour sélectionner le jeu de filtres approprié. Sélectionnez le mode de champ large de fluorescence et utilisez les oculaires pour sélectionner un champ de vision contenant des cellules exprimant le capteur AMP cyclique FRET.

Ouvrez le logiciel d’imagerie, sélectionnez le mode confocal et déverrouillez le bouton de verrouillage laser. Ouvrez le menu des paramètres A1. Cochez les cases correspondant aux lignes laser de 405 et 561 nanomètres et réglez ces détections spectrales sur SD, la résolution sur 10 et les canaux sur 32.

Sélectionnez les valeurs de longueur d’onde de début et de fin pour définir la plage de longueurs d’onde. Ouvrez le menu Paramètres A1 pour sélectionner l’icône de saut de compartimentage. Sélectionnez la case numéro 15 et cliquez sur OK. Réglez les intensités laser à huit pour cent pour le laser de 405 nanomètres et à deux pour cent pour le laser de 561 nanomètres.

Réglez le gain du détecteur sur 149 et le rayon du sténopé sur 2,4 unités de disque Airy. Réglez la vitesse de balayage sur 25 images spectrales par seconde et sélectionnez la direction de balayage unidirectionnelle. Définissez le nombre sur quatre et la taille de numérisation sur 1024 par 1024.

Pour définir les paramètres d’acquisition de la pile z, cliquez sur Affichage, Contrôle d’acquisition et Acquisition ND, puis entrez la destination et le nom du fichier dans la fenêtre contextuelle pour enregistrer le fichier ND. Cliquez sur la case série z et cliquez sur En direct dans la fenêtre Paramètres A1 Plus pour ouvrir une fenêtre d’affichage en direct. Ajustez le bouton de mise au point pour vous concentrer sur les cellules tout en regardant dans la fenêtre d’aperçu.

Ajustez le bouton de mise au point du microscope pour sélectionner le haut de la cellule et cliquez sur Haut dans la fenêtre d’acquisition ND pour définir la position actuelle comme haut. Ajustez le bouton de mise au point du microscope pour sélectionner le bas de la cellule et cliquez sur Bas pour définir la position actuelle comme bas. Entrez un micromètre pour la taille du pas.

Sélectionnez En haut en bas pour la direction du balayage z et cliquez sur Exécuter pour acquérir une pile z. Lorsque l’acquisition de la pile z est terminée, utilisez une pipette pour ajouter doucement le réactif d’intérêt dans la chambre sans perturber les cellules. Au bout de 10 minutes, modifiez le nom du fichier et acquérez une deuxième image z-stack.

Après l’imagerie, créez de nouveaux dossiers avec les mêmes noms de fichiers que les images spectrales de la pile z et ouvrez le fichier d’image spectrale qui vous intéresse. Cliquez sur Fichier, Importer/Exporter et Exporter le document ND. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le dossier nouvellement créé, TIFF pour le type de fichier, Image mono pour chaque canal et conservez la profondeur de bits.

Cliquez sur Exporter pour exporter les fichiers individuels dans le dossier et ouvrez le logiciel de démixage spectral linéaire. Ouvrez le démixage linéaire. m et cliquez sur Exécuter.

Recherchez et sélectionnez le dossier contenant la séquence de fichiers TIFF exportée, puis cliquez sur OK pour ouvrir la fenêtre de longueur d’onde et de tranche z. Copiez le nom de fichier du premier fichier sans la tranche z et le numéro de canal du dossier et collez-le dans la première étape de la zone Entrer le nom de l’image, entrez le nombre de canaux dans la zone Entrez le nombre de bandes de longueur d’onde et le nombre de tranches z dans la zone Entrez le nombre de tranches Z et cliquez sur OK. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle, parcourez et sélectionnez la longueur d’onde. mat et cliquez sur Ouvrir.

Parcourez et sélectionnez le fichier Library. mat dans la nouvelle fenêtre contextuelle et cliquez à nouveau sur Ouvrir pour lancer le démixage de la tranche. Pour calculer l’efficacité du FRET, ouvrez le multiFRRCF.

m et entrez le nombre d’essais expérimentaux à analyser dans la case Combien de dossiers à retrancher. Cliquez sur OK. Sélectionnez les dossiers non mélangés et cliquez à nouveau sur OK. Dans la nouvelle fenêtre contextuelle, définissez le facteur d’échelle sur 12,4, le seuil sur 56, les fréquences X, Y et Z sur cinq, cinq et un respectivement, et l’algorithme de lissage sur Gaussian.

Cliquez ensuite sur Exécuter pour effectuer les mesures et le découpage FRET. Pour mapper l’efficacité du FRET aux niveaux d’AMP cycliques, ouvrez le Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m et cliquez sur Exécuter.

Naviguez jusqu’à la première image FRET en niveaux de gris et sélectionnez-la, puis cliquez sur OK. Ouvrez ensuite les images de l’AMP cyclique FRET pour inspecter la distribution des signaux de l’AMP cyclique en trois dimensions. Dans ces images, des vues tridimensionnelles de données d’images hyperspectrales brutes faussement colorées acquises par microscopie confocale au départ et 10 minutes après le traitement à la forskoline peuvent être observées. Dans cette analyse, un fluorophore accepteur a été complètement photodétruit, ce qui a permis d’obtenir des signatures spectrales du donneur et de l’accepteur avec une stœchiométrie individuelle.

Des cellules non transfectées marquées avec un colorant nucléaire ont été utilisées pour obtenir le spectre pur du fluorophore du colorant. La combinaison des spectres des fluorophores donneurs, accepteurs et à colorant nucléaire permet de créer une bibliothèque à trois composants. Ici, les sources de trois signatures spectrales de fond peuvent être observées.

Bien que ces signaux soient distribués de manière non uniforme dans l’échantillon et qu’ils ne puissent pas simplement être soustraits, l’ajout des signatures spectrales de ces signaux à la bibliothèque spectrale et l’utilisation du démélange linéaire pour séparer les signaux fournissent une approche permettant d’éliminer ces signaux confondants des signaux donneurs et accepteurs avant de calculer leur efficacité FRET. La bibliothèque spectrale à six composantes peut ensuite être utilisée pour effectuer un démélange spectral linéaire pour chaque tranche de l’image axiale. Ici, les changements dans l’efficacité FRET et les niveaux d’AMP cyclique dans différentes tranches de plan XY peuvent être observés, ce qui permet une comparaison entre les conditions de base et les conditions 10 minutes après le traitement à la forskoline.

Cette technique pourrait également être utilisée pour quantifier l’efficacité FRET d’autres rapporteurs en trois dimensions dans les cellules et les tissus.