La microscopie à force atomique combinée à la spectroscopie infrarouge comme outil pour sonder la chimie d’une seule bactérie

La méthode permet d’étudier les bactéries à l’échelle nanométrique. Il nous fournit un aperçu détaillé des altérations chimiques de la résistance aux antimicrobiens. Par conséquent, il peut contribuer à notre compréhension de la résistance aux antimicrobiens et du développement de médicaments.

La taille nanométrique des bactéries limite considérablement les outils de recherche disponibles capables d’explorer leur chimie. AFM-IR nous permet de le faire de manière non destructive, indépendante de l’observateur, même au niveau subcellulaire. En fournissant un aperçu de la résistance aux antimicrobiens, la méthode peut aider à identifier et à tester des cibles moléculaires pour de nouveaux antimicrobiens.

En plus des bactéries, l’AFM-IR peut sonder une gamme de cellules, de tissus et même de virus. Pour préparer un échantillon pour l’imagerie AFM-IR, après avoir cultivé les bactéries d’intérêt sur le milieu approprié dans les conditions de culture appropriées, utilisez une boucle stérile pour prélever soigneusement les bactéries du haut des colonies afin de les transférer dans un tube de verre. Ajoutez un millilitre d’eau ultrapure dans le tube et agitez pendant une à deux minutes jusqu’à ce que la pastille bactérienne recueillie ne soit plus visible au fond du tube.

Estimez la turbidité approximative de la solution par comparaison visuelle entre la solution préparée et les étalons McFarland. Si la turbidité de la suspension bactérienne semble très faible, continuer à ajouter d’autres bactéries et à vortex jusqu’à ce que la turbidité rugueuse de la solution soit comparable aux étalons McFarland de 0,5 et 1. Granulez les bactéries par centrifugation et aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.

Remettez en suspension les pastilles de cellules bactériennes dans un millilitre d’eau ultra-pure avec vortex, et sédimentez les bactéries avec une autre centrifugation. Après avoir lavé les bactéries jusqu’à trois fois de plus, comme nous venons de le démontrer, aspirez le surnageant et faites tourbillonner la pastille pendant au moins deux minutes avant d’ajouter cinq microlitres de cellules sur le substrat expérimental. Si l’épaisseur souhaitée est une monocouche ou des bactéries individuelles, immédiatement après le dépôt, ajoutez entre 20 et 100 microlitres d’eau ultrapure au substrat et mélangez doucement la solution avec une pointe de pipette.

Lorsque l’échantillon a séché à l’air, utilisez du ruban adhésif double face pour monter le substrat sur un disque d’échantillon métallique AFM. Pour préparer l’instrument de spectroscopie AFM-IR à une analyse, appuyez sur Initialiser après avoir allumé le logiciel et le laser et vérifiez que l’obturateur laser est en position ouverte. Au cours de ce processus, la fenêtre d’initialisation de l’étape apparaîtra.

Une fois le processus d’initialisation terminé, cliquez sur Initialiser et sur OK. Si possible, activez le flux d’azote pour purger l’instrument avec de l’azote et ajustez la purge d’azote pour obtenir un niveau d’humidité stable. Placez soigneusement l’échantillon dans la chambre d’échantillonnage sans endommager la pointe et cliquez sur Charger dans le logiciel. Suivez l’assistant pour charger l’échantillon, en vous concentrant sur l’astuce et sur l’échantillon à chaque étape.

Cliquez ensuite sur Approche pour approcher l’échantillon sans intervenir. Avant d’engager l’échantillon, sélectionnez Outils, Étalonnage de l’arrière-plan IR et Nouveau. Dans la fenêtre contextuelle, définissez la résolution et la plage spectrale en fonction de l’objectif de l’analyse et définissez les co-moyennes et les arrière-plans sur des valeurs moyennes.

Sélectionnez Activer. Dans la fenêtre contextuelle, définissez les paramètres de début et de fin, puis cliquez sur Accepter et acquérir. Une fois les données d’arrière-plan acquises, cliquez sur Enregistrer.

Pour activer la pointe de l’échantillon, cliquez sur Engager. Le système s’approchera de la surface de l’échantillon jusqu’à ce qu’un contact direct soit détecté. Cliquez sur Scanner pour collecter une première image AFM de plus grande surface, à faible résolution spatiale, afin de visualiser la surface avant de déplacer la pointe vers un point de mesure d’intérêt.

Pour aligner le laser infrarouge sur un numéro d’onde auquel l’échantillon sera absorbé, entrez le numéro d’onde auquel l’échantillon sera absorbé dans le champ Numéro d’onde, puis cliquez sur Démarrer IR.At au moins un pic clair doit être observé dans le graphique Amplitude en fonction de la fréquence. Le graphique Déviation en fonction du temps doit montrer une forme d’onde périodique. Cliquez sur Optimiser pour sélectionner un spectre de bactéries infrarouges conventionnel afin d’identifier les positions des bandes, et utilisez le spectre pour optimiser les points chauds à différentes valeurs de nombre d’onde de différentes régions spectrales.

Lorsque les spots infrarouges pour les valeurs de nombre d’onde sélectionnées ont été optimisés, définissez la résolution spectrale, la plage et le nombre de co-moyennes et cliquez sur Acquérir pour collecter le spectre AFM-IR. Pour collecter une image de distribution d’intensité pour une valeur de numéro d’onde sélectionnée, après avoir enregistré un seul spectre AFM-IR, enregistrez une image AFM de la zone d’échantillon sélectionnée et sélectionnez les valeurs de nombre d’onde pour l’imagerie AFM-IR. Vérifiez que le spot IR du laser a été optimisé pour les valeurs de nombre d’onde sélectionnées et définissez le nombre de points de données dans les directions X et Y de la zone d’image.

Dans la fenêtre Général, réglez la puissance du laser. Dans la fenêtre Balayage AFM, définissez la fréquence de balayage. Cochez ensuite la case Activation de l’imagerie IR et cliquez sur Scanner pour commencer l’imagerie.

L’AFM-IR de l’intensité du signal au numéro d’onde sélectionné sera collecté en même temps que les données AFM de cette zone. Ce protocole permet l’acquisition d’une gamme de types de distributions de cellules bactériennes sur un substrat, des cellules uniques aux monocouches et multicouches. Le protocole peut être utilisé pour surveiller les changements dynamiques dans les bactéries vivantes.

Par exemple, dans la formation d’un septum lors de la division cellulaire de S. aureus. Le spectre AFM-IR du septum a été caractérisé par une intensité relative plus élevée des bandes à 1, 240 et 1 090 centimètres par rapport aux spectres AFM-IR collectés dans la zone cellulaire, ce qui suggère que le septum est composé de groupes de glucides et de phosphodiester des composants de la paroi cellulaire. Le protocole peut également être utilisé pour étudier les différences de composition chimique résultant du développement d’une résistance.

Comme observé dans cette analyse représentative, aucune différence morphologique n’a été mesurée entre la résistance intermittente à la vancomycine et les cellules S. aureus sensibles à la vancomycine. L’évaluation des spectres AFM-IR et de leurs seconds dérivés, cependant, a révélé une nette augmentation de l’intensité relative des bandes associées aux groupes glucides et phosphodiester des composants de la paroi cellulaire de la souche résistante par rapport à l’homologue sensible. Il est important de préparer un échantillon propre, alors veillez à réduire la contribution du fluide dès le début et à l’éliminer complètement de plusieurs lavages.

Étant donné que l’AFM-IR est une technique non destructive, l’échantillon peut être étudié ultérieurement avec d’autres techniques, telles que la coloration ou la spectroscopie d’ions confocales, qui peuvent fournir des informations complémentaires sur leur chimie.