Chargement d’échantillons cryogéniques dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire à angle magique qui préserve la viabilité cellulaire

La sensibilité de la spectroscopie RMN MAS assistée par DNP nous permet de caractériser les protéines à l’intérieur des cellules intactes à leur concentration endogène. Cette application nécessite une manipulation soigneuse des échantillons. Certaines morphologies sont préservées et les cellules sont viables lorsqu’elles sont cryogénisées dans le spectromètre selon ce protocole.

L’introduction du rotor froid peut provoquer une accumulation d’humidité et de glace, ce qui peut empêcher mécaniquement la rotation de l’échantillon. Cette démonstration guidera les expériences pour effectuer le transfert cryogénique en toute confiance. Pour commencer, placez un coussin fabriqué à partir d’un morceau de mouchoir ou d’essuie-tout sous le couvercle et au fond du flacon cryogénique.

Placez le rotor en saphir de 3,2 millimètres dans le flacon cryogénique rembourré de papier de soie, l’extrémité marquée faisant face au fond du flacon. Gelez lentement le rotor en plaçant le flacon dans un récipient de refroidissement à débit contrôlé et placez le récipient dans un congélateur à 80 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Transférez le flacon cryogénique contenant le rotor congelé dans une petite fiole à vide remplie d’azote liquide.

Utilisez la fiole à vide pour transporter l’échantillon vers le spectromètre. Remplissez une bouteille isotherme à mousse large, sèche et isolée thermiquement avec 500 millilitres pour un litre d’azote liquide. Prenez le flacon cryogénique du ballon de transfert et tenez-le juste au-dessus de la surface de l’azote liquide pour le protéger de l’atmosphère.

Tout en tenant le flacon cryogénique avec la bouche du flacon légèrement orientée vers le bas, dévissez le bouchon et laissez le rotor glisser dans le bain d’azote liquide. Pré-refroidissez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre en l’immergeant dans l’azote liquide. Sous la surface du bain d’azote liquide, utilisez une pince à épiler pour transférer le rotor dans le tube de la microcentrifugeuse, l’embout d’entraînement faisant face au bas du tube et les marques faisant face à l’ouverture.

À l’aide d’une pince à épiler, maintenez le tube contenant le rotor sous l’azote liquide par son col. À l’aide d’une deuxième pince à épiler, tenez le récupérateur d’échantillons RMN au-dessus de la surface de l’azote liquide incliné à un angle aigu par rapport au tube de la microcentrifugeuse. Pour transférer le rotor du récupérateur d’échantillons RMN au spectromètre RMN, placez l’armoire cryogénique en mode éjection en appuyant sur éjection.

Insérez l’extrémité ouverte du récupérateur d’échantillons RMN dans le tube de microcentrifugation tout en restant sous la surface de l’azote liquide. Soulevez à la fois le tube de microcentrifugation et le récupérateur d’échantillons RMN pour permettre au rotor de tomber dans le récupérateur d’échantillons. Secouez le récupérateur d’échantillons et le tube si le rotor se coince sur la jante.

Laissez le tube de microcentrifugation vide sur le dessus du récupérateur d’échantillons RMN pour protéger le rotor de l’air. Retirez l’autre récupérateur d’échantillons vide de la sonde et posez-le sur le sol. Transférez le récupérateur d’échantillons RMN contenant le rotor dans l’autre main.

Retirez ensuite le tube de microcentrifugation et insérez-le immédiatement dans la sonde. Signalez à la personne qui utilise l’armoire cryogénique d’appuyer sur stop, eject et insert. Faites tourner l’échantillon à la vitesse de rotation souhaitée en ajustant le roulement et la pression d’écoulement d’entraînement.

Versez 500 millilitres à un litre d’azote liquide dans une fiole à mousse à large ouverture et placez le bain sous le spectromètre. Immergez le flacon cryogénique vide contenant un morceau de papier de soie dans le bain d’azote liquide. Réduisez la vitesse de rotation à zéro kilohertz en réduisant le débit de gaz d’entraînement et de roulement, et éjectez le rotor en passant en mode d’éjection.

Tout en gardant le mode d’éjection activé, retirez le récupérateur d’échantillons de la sonde et déposez le rotor directement dans le flacon en mousse à large ouverture contenant de l’azote liquide. À l’aide d’une pince à épiler pré-refroidie, transférez le rotor dans le flacon cryogénique pré-refroidi sous la surface de l’azote liquide. Pré-refroidissez le bouchon du flacon cryogénique en le trempant dans de l’azote liquide.

Retirez le flacon contenant le rotor et l’azote liquide du bain et bouchez le tube avec le bouchon pré-refroidi. Replongez le flacon cryogénique dans de l’azote liquide. L’échantillon peut être transféré dans un stockage d’azote liquide à plus long terme ou déballé immédiatement pour une analyse plus approfondie.

L’insertion cryogénique d’échantillons précongelés de cellules de mammifères dans le spectromètre RMN soutient la viabilité tout au long de l’expérience RMN. En utilisant ce protocole, la perméabilité au bleu trypan des cellules de mammifères après RMN MAS est similaire à celle des cellules non exposées à un changement de température. Si les cellules sont congelées lentement, puis réchauffées à température ambiante avant d’être insérées, la viabilité cellulaire diminue à moins de 10 %Pendant ce temps, l’insertion cryogénique d’échantillons congelés de cellules de mammifères soutient la viabilité cellulaire tout au long de l’expérience RMN.

Lorsque vous essayez d’effectuer un protocole, demandez de l’aide pour appuyer sur l’éjection et faire tourner l’échantillon afin que l’échantillon puisse être introduit dans la sonde avant qu’elle ne se réchauffe, en vous assurant qu’aucune humidité n’est introduite dans la sonde bien sûr que le spectromètre fonctionnera à froid pendant de nombreuses semaines. Ce protocole s’applique à tout système où les fluctuations de température peuvent compromettre l’intégrité de l’échantillon, comme les réactions d’extinction par congélation, ou la caractérisation des intermédiaires de réaction piégés, l’enzymologie et le repliement des protéines.