Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Le microenvironnement permet un cytokines, une concentration et une composition très complexes et dynamiques, y compris des cytokines en constante évolution. Créer un environnement culturel similaire est crucial pour les études in vitro sur des machines de vie complexes telles que la différenciation des cellules souches, les réponses immunitaires et le développement d’organes sur des plates-formes de puces. Mais il est difficile de générer et de délivrer des signaux chimiques de volume nanolimétrique et de précision millisecondes en utilisant des approches biomédicales conventionnelles comme le pipetage.

Pour relever les défis, une plate-forme culturelle capable d’alterner la génération d’acquisition d’images d’entrées de signaux combinatoires et séquentielles dynamiques est très demandée. Dans ce protocole, la procédure de conception et de fabrication d’un dispositif microfluidique est présentée. La puce microfluidique proposée se compose de 1500 unités de culture, d’un éventail de pompes périssaltiques améliorées et de modules de mélange sur place.

Nous démontrons que la plate-forme est appropriée pour des études sur des cellules simples les populations cellulaires bidimensionnelles et les sphères neurales tridimensionnelles. Les conditions environnementales complexes et dynamiques sur les copeaux ont de grands effets sur la différenciation des cellules souches neurales et l’auto-renouvellement. Le détail des procédures de conception et de fabrication est le suivant.

La conception des puces a été effectuée à l’aide du logiciel AutoCAD. Pour s’adapter à la taille du porte-plaques au microscope, la puce microfluidique mesure environ sept à cinq centimètres et se compose de 1500 chambres de culture. Une des caractéristiques importantes est qu’il a pompe périssaliste qui se compose de huit canaux d’écoulement et 200 canaux de contrôle de large micromètre.

L’augmentation de la zone de chevauchement entre le contrôle et le canal d’écoulement augmente 16 fois par rapport à la pompe périssaliste, proposée par Stephen Quake en 2002, à environ 15 nanolitres liquides et par cycle de pompage et suffit à maintenir 1500 conditions environnementales indépendantes parallèlement sur puce. Une autre partie importante de l’appareil est une chambre de culture à deux couches, qui peut maintenir un environnement culturel sans cisaillement. Le stress de cisaillement indésirable est évité en le dirigeant rapidement à travers la couche supérieure.

Les cellules, les tissus et le milieu conditionnel crucial restent intacts à la couche inférieure. La simulation numérique suggère que lorsque les liquides sont dirigés à travers les chambres de culture, de gauche à droite. les forces de cisaillement peuvent être efficacement empêchées.

Même à un débit d’entrée de 10 millimètres par seconde de cellule ou de tissu de la taille d’un micromètre, il n’est pas perturbé au fond de l’unité de culture. Nous avons fabriqué la réplique moulage ou plaquette de silicium en utilisant la lithographie UV. Les canaux fluidiques de 25 micromètres de hauteur et de 100 micromètres de poids sont produits à l’aide d’un photorésistant négatif SU-8 3025.

Les chambres de culture de 75 micromètres et de 150 micromètres de hauteur ont été fabriquées à l’aide du photorésistant SU-8 3075. AZ50X photorésiste positif est utilisé pour les caractéristiques de puits en forme ronde qui se chevauchent avec les canaux de contrôle pour assurer une bonne connexion. Pour produire la puce microfludique, les plaquettes de silicium à motifs et vierges ont d’abord été traitées avec TMCS.

Différentes quantités de PDMS 10 à 1 de rapport monomère/catalyseur ont été complètement mélangées et débobbleées pendant une à deux heures dans la chambre à vide à moins 0,85 mégapascal. La couche de commande a été obtenue par pdms de revêtement de spin à 2,200 RPM. Les plaquettes de silicium ont ensuite été transférées à l’incubateur et incubées pendant 60 minutes à 80 centigrades.

Différentes couches ont été alignées et collées ensemble à l’aide d’un dispositif optique personnalisé et d’une machine à graver le plasma. Les trous d’entrée ont ensuite été perforés après deux autres heures de liaison thermique à 80 centigrades. La puce a été collée à un glissement de couvercle recouvert de PDMS, qui est de la même taille de plaque de 96 puits et durcie pendant au moins 12 heures à 80 centrigrades avant utilisation.

Pour le fonctionnement, les canaux de commande ont été raccordés aux valves solénoïdes pneumatiques miniatures par le tube en plastique. Tous les puits pénitents tournants ont été contrôlés par un programme MATLAB personnalisé à travers l’interface utilisateur graphique. Les pressions de fermeture optimales des valves membranaires PDMS push-up ont été déterminées individuellement pour chaque puce, qui varie généralement de 25 à 30 PSI.

En tournant toutes les séries de puits dynamiquement combinatoires et séquentiels, les entrées peuvent être générées sur puce. Les cellules ont été récoltées à 80% confluent et réutilisées avec la culture moyenne DMEM à une densité d’environ 10 à la puissance six par millilitre, qui ont ensuite été chargés dans la puce en pressurisant la cellule contenant la solution. Tant pour l’adhérent que pour la culture de suspension des cellules souches neurologiques, des cellules ont été recueillies et les sphères ont été directement chargées dans la puce.

Pour l’acquisition d’images, un microscope inversé avec une étape translationnelle automatique et l’appareil photo semi-conducteur d’oxyde métallique complémentaire numérique ont été utilisés. L’acquisition de l’étape et de l’image ont été contrôlées via le logiciel montre le coin supérieur gauche et les chambres inférieures du coin droit comme points de sélection et déplacer l’étape translationnelle vers les points ordonnés pour obtenir l’imagerie préliminaire avec objectif 4x lentille. Modifiez l’objectif 4x avec le 20x one et ajustez les paramètres d’imagerie, y compris l’intensité lumineuse, exposez le temps, et cetera.

Ensuite, localisez les points de sélection de sorte que la position de chaque chambre laissant 13 par 15 matrice de chambre ou d’être défini par le programme automatiquement. Avec la détermination des coordonnées des chambres, l’étape translationnelle se déplace vers chaque chambre où X, Y, Z plan focal peut être peaufiné. Définissez l’intervalle et la durée du cycle d’imagerie.

Enregistrez le chemin, puis commencez l’imagerie. Ce système est disponible pour divers suivi dynamique cible, tels que la différenciation des cellules souches neurales dans brightfield et le champ de fluorescence du processus de formation de la sphère des cellules souches neurales. Analyse des données.

Modifiez le format en nd2 en Tif en utilisant le programme MATLAB personnalisé. Et diviser les données en fonction des points. Sélectionnez l’objet à analyser est cellule ou tissu.

Entrez le seuil, la taille de l’objet, la taille du bruit à l’analyse. Ou vous pouvez choisir l’analyse étape par étape pour des paramètres optimaux. Et puis analyser toutes les données.

Après avoir sauvé le résultat dans le format MAT, en utilisant l’intrigue pour dessiner les résultats ou les traces. Dans cet article, nous avons décrit le protocole et la culture du système de puce microfluidique à haut débit basé sur la technologie de photolithographie pour le contrôle dynamique de microenvironnement cellulaire vivant. Nous avons également décrit certains paramètres que l’on devrait contrôler soigneusement, comme la pression de fermeture des valves membranaires PDMS et le contrôle de rotation du fluide en parallèle de la chambre.

Dans la culture in vitro cellulaire traditionnelle, le traitement de l’environnement de culture cellulaire est effectué manuellement, ce qui prend beaucoup de temps et laborieux et rempli de liquide n’est pas facile à contrôler standard. En particulier les minutes de solution. Il y a certains problèmes tels que la génération d’intrants, la concentration de médicaments immunitaires et une grande consommation.

Cependant, en utilisant notre système microfluidique, il est possible de le répéter comme stimulateur à dose fixe un seul fluide égale quantité de concentration uniforme, comparer différentes cultures dans différentes chambres de culture en même temps. Différent avec une certaine résolution temporelle miniature stimulus arrière et avec subsetting la résolution en régulant le fluide. En outre, notre système peut obtenir un grand nombre de résultats expérimentaux comparatifs par des opérations simples.

Notre système est basé sur le principe de diffusion, crée une perturbation mécanique minimale du microenvironnement cellulaire. Pour des puces de microenvironnement cellulaires plus stables, vous pouvez augmenter la liste de la couche tampon comme la profondeur de la couche de culture ou réduire le fluide d’entrée de l’échange moyen, c’est-à-dire réduire la pression, qui sera là pour la recherche sur le comportement cellulaire. Il faut remarquer que cette étude n’a examiné que la culture des cellules 3T3 et NSC.

Pour d’autres cellules ou lignées cellulaires, les conditions de culture comparables à nos paramètres pour l’ajuster.