Microscopie 4D: Démêler le développement embryonnaire de Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie Nomarski

microscopie 4D est un outil précieux pour reconstruire la lignée cellulaire complète de l’embryon de C. elegans ou de tout autre spécimen au niveau de la cellule unique. L’optique Nomarski peut être utilisée pour mettre en évidence les changements de forme des cellules au cours du développement avec un microscope standard et la lumière transmise sans avoir besoin d’animaux transgéniques ou de microscopie à fluorescence. Le microscope 4D permet d’étudier le cycle cellulaire, la prolifération, la différenciation et l’apoptose chez C. elegans et dans d’autres systèmes tels que les mammifères ou la culture de cellules tissulaires.

Le traçage de la lignée cellulaire sur les images DIC est effectué manuellement. Cela prend du temps et nécessite un peu de pratique pour effectuer une analyse complète de l’embryon. Begona Ezcurra, technicienne dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Avant de préparer les embryons, ajustez la température d’enregistrement du microscope 4D à 15, 20 ou 25 degrés Celsius et réglez le microscope pour enregistrer 1 500 piles z de 30 plans focaux espacées d’un micron avec des intervalles de 30 secondes entre le début de chaque empilement. Ensuite, aliquote 500 à 1000 microlitres de gélose liquide à 4,5 % dans des tubes en verre de trois millimètres et scellez soigneusement les tubes avec un film de cire pour éviter la dessiccation. Pour préparer un tampon gélosé mince et homogène pour l’enregistrement, chauffez soigneusement et aliquote de gélose sur un brûleur à alcool jusqu’à ce que la gélose soit fondue et placez le tube dans un bloc de chaleur à 80 degrés Celsius.

Placez une lame de microscope en verre sur un morceau de plastique et utilisez une pipette de pâturage dans une main pour placer une petite goutte de gélose fondue au centre de la lame, puis utilisez immédiatement l’autre main pour placer une deuxième lame sur la goutte de gélose pour créer un tampon de gélose très fin. Pour monter les embryons, utilisez d’abord un cueilleur pour transférer 5 à 10 hermaphrodites gravides dans un verre d’horloger rempli d’eau sous un stéréomicroscope. À l’aide d’un scalpel, ouvrez les nématodes hermaphrodites et extrayez un à quatre premiers œufs de l’utérus.

Faites glisser doucement la glissière supérieure du tampon gélosé et utilisez un tube capillaire pour placer un œuf précoce au centre du tampon. Utilisez un cil collé à l’extrémité d’un cure-dent pour ajuster la position de l’œuf si nécessaire, et utilisez la pipette capillaire pour enlever tout excès d’eau. À l’aide d’un scalpel, drapez lentement et obliquement la lamelle sur la préparation avant d’utiliser une micropipette pour remplir les 3/4 de l’espace entourant le tampon gélosé avec de l’eau.

Scellez ensuite la lamelle avec de la vaseline pour éviter la dessiccation pendant les longues périodes d’enregistrement. Après le scellement, placez la lame sur la platine du microscope 4D et utilisez un objectif à faible grossissement pour faire la mise au point sur l’embryon. Sélectionnez l’objectif d’immersion 100X et faites la mise au point sur le condenseur.

Ouvrez complètement l’ouverture du condenseur et fermez le diaphragme de champ pour obtenir une ouverture numérique plus élevée et une plus grande résolution. Tournez le prisme de Wollaston pour obtenir une image tridimensionnelle de l’embryon éclairé d’un côté, puis tournez le prisme dans l’autre sens pour obtenir l’effet d’avoir l’embryon éclairé de l’autre côté et commencez l’enregistrement 4D. Pour la reconstruction de la lignée cellulaire d’un embryon enregistré dans un film 4D, ouvrez le logiciel de traçage de la lignée et sélectionnez Fichier et Nouveau projet.

Sélectionnez le modèle de lignage cellulaire approprié en fonction de la température d’enregistrement et réglez le nombre de balayages sur 1500. Le temps entre les balayages est de 30 secondes, le nombre de niveaux est de 30 et la distance entre les niveaux est d’un micron. Sélectionnez le fichier image, le format et le répertoire dans lesquels les images ont été enregistrées.

Indiquez si les images ont été enregistrées en tant qu’images uniques ou en tant que piles z multi-images, puis définissez le nom des fichiers et les formats d’image. Cliquez ensuite sur Traitement des canaux activé pour détecter et définir les canaux de lumière appropriés du film 4D. Pour le traçage de la lignage cellulaire, lancez le logiciel de traçage de la lignage cellulaire.

Une fenêtre vidéo et une fenêtre de traçabilité de cellule s’affichent. Dans la fenêtre de lignage, sélectionnez la branche de lignage et cliquez sur le noyau de cellule correspondant à cette cellule dans la fenêtre vidéo. Lisez le film 4D vers l’avant, vers l’arrière, vers le haut ou vers le bas d’un niveau pour suivre la cellule d’intérêt dans l’espace au fil du temps.

Cliquez périodiquement sur le noyau de la cellule pour générer un point dans la branche de lignage et pour enregistrer les coordonnées spatiales de la cellule à un moment précis. En conséquence, des progressions de lignées cellulaires et des reconstructions 3D de l’embryon sont possibles. Appuyez ensuite sur la touche retour pour marquer la mitose et sélectionnez l’une des cellules filles pour suivre la progression cellulaire comme nous venons de le démontrer.

Répétez l’analyse pour le reste des cellules embryonnaires afin de retracer la lignée cellulaire complète ou de suivre des cellules d’intérêt spécifiques, telles que celles subissant une apoptose. Permettre la comparaison des lignées mutantes d’intérêt avec la lignée cellulaire stéréotypée de C. elegans de type sauvage. Les plaques à vis sans fin sont incubées dans des boîtes en carton pour éviter la condensation.

Une fois l’enregistrement terminé, la lignée cellulaire peut être reconstruite à l’aide d’un logiciel de traçage de lignage, comme démontré. Par exemple, dans cette analyse représentative, la lignée cellulaire embryonnaire mutante gsr-1 tracée a été comparée à la lignée de type sauvage de C. elegans. Et la détection d’un retard progressif dans le cycle cellulaire au cours du développement embryonnaire a été révélée.

En conséquence, les embryons mutants s’arrêtaient à des stades intermédiaires tandis que les embryons de type sauvage progressaient et finissaient par éclore sous forme de larves. De plus, d’autres caractéristiques importantes du développement embryonnaire, telles que l’apoptose, peuvent être visualisées dynamiquement à l’aide de la microscopie 4D. Le traçage de lignage des images DIC doit être traité manuellement.

Un logiciel de traitement de cellules non marquées à la lumière visible aux premiers stades de développement n’est pas précis pour l’analyse de l’embryon. L’application du système de reconnaissance d’images au domaine de la microscopie en lumière visible apportera une grande avancée dans le domaine de la biologie du développement.