Name: Un modèle d’AVC photothrombotique enrichi en fibrine et sensible au tPA (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez un modèle d'AVC photothrombotique modifié utilisant la thrombine et le rose bengale pour créer des caillots fibrine-plaquettes sensibles au tPA. Cette méthode améliore la recherche préclinique sur les traitements thrombolytiques.

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Ce travail a été soutenu par les subventions du NIH (NS108763, NS100419, NS095064 et HD080429 à C.Y.K. ; et NS106592 à Y.Y.S.).

Ce protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie et suit les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1A décrit la séquence des interventions chirurgicales de ce protocole.
1. Configuration de la chirurgie
<ol><li>Placez un coussin chauffant avec une température réglée à 37 °C sur l’adaptateur pour petit animal au moins 15 minutes avant l’opération. Préparez un rouleau de pince-nez pour l’adaptateur qui permet la rotation de la tête de l’animal. Préparer les anesthésiques Kétamine (60 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg).</li>
	<li>Stériliser les outils chirurgicaux, y compris les ciseaux, les pinces, les porte-micro-aiguilles, les hémostatiques, les cotons-tiges et les sutures avec un autoclave (121 °C à 15 psi pendant 60 min). Préparez de la colle pour tissus et de la pommade pour les yeux. Préparez les lunettes de protection laser 532 nm pour les chirurgiens. REMARQUE : Ce protocole décrit une intervention chirurgicale de survie majeure et doit être effectué à l’aide de techniques aseptiques.</li>
	<li>Installez le système d’éclairage avec une source laser de 532 nm. Préparez une perceuse dentaire.</li>
	<li>Préparez la solution de Rose Bengal dans une solution saline (10 mg/mL). Placer une aliquote de thrombine bovine (0,1 U/μL) dans un seau à glace.</li>
	<li>Injecter du kétoprofène (4,0 mg/kg) par voie sous-cutanée à la souris comme analgésie 30 min avant la chirurgie ou utiliser le schéma analgésique recommandé par les directives institutionnelles locales.</li>
</ol>2. Ligature de l’artère carotide commune ipsilatérale
<ol><li>Anesthésier des souris mâles C57BL/6NCrl âgées de 10 à 14 semaines pesant de 22 à 30 g par injection intramusculaire de kétamine (60 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). REMARQUE : L’ensemble de l’intervention chirurgicale, englobant la ligature de l’artère carotide commune ipsilatérale par la surveillance du flux sanguin cérébral, devrait prendre ~ 120 min. Le régime anesthésique sera généralement efficace pendant toute cette durée, mais la profondeur de l’anesthésie doit être réévaluée au moins toutes les 15 minutes. Lors de l’apprentissage de ces procédures, il peut être nécessaire de redoser l’anesthésie.</li>
	<li>Effectuez un pincement des orteils pour vous assurer que l’animal est complètement anesthésié. Enlevez les poils du cou gauche pour la ligature de l’ACC et de la tête pour l’amincissement du crâne avec la crème dépilatoire.</li>
	<li>Placez la souris sur l’adaptateur pour petit animal en position couchée sur le dos. Stérilisez la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois pulvérisations alternées de povidone iodée et d’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Fixez la tête de la souris à l’aide de barres d’oreille. À l’aide d’un microscope à dissection, faites une incision cervicale gauche de 0,5 cm à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite à environ 0,2 cm latéralement de la ligne médiane.</li>
	<li>Utilisez une paire de pinces finement dentelées pour séparer les tissus mous et le fascia afin d’exposer l’artère carotide commune gauche (LCCA). Séparez soigneusement l’ACC gauche du nerf vagal à l’aide d’une paire de pinces fines et lisses.</li>
	<li>Placez une suture permanente à double nœud autour du LCCA à l’aide d’une suture en soie 5-0 coupée en segments de 20 mm, puis fermez la plaie à l’aide de pinces stériles.</li>
</ol>3. Amincissement du crâne au-dessus de la branche MCA et photoactivation
<ol><li>Retournez la souris en position couchée sur l’adaptateur pour petits animaux. Faites pivoter le rouleau du pince-nez de 15°. Stérilisez la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois pulvérisations alternées de bétadine et d’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Faites une incision de 0,8 cm dans le cuir chevelu à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite le long de l’œil gauche et de l’oreille pour exposer le muscle temporal, qui est situé entre l’œil et l’oreille (Figure 1B).</li>
	<li>Sous le microscope à dissection, faites une incision de 0,5 cm le long du bord du muscle temporal sur l’os pariétal gauche à l’aide d’une paire de pinces finement dentelées. Faites une deuxième incision verticale de 0,3 cm sur le muscle temporal à l’aide d’un micro ciseaux. Rétractez le muscle temporal pour exposer le bord de l’os pariétal et de l’os squamosal. Assurez-vous de visualiser le point de repère de la suture coronale entre les os frontaux et pariétaux (Figure 1B,C).</li>
	<li>Humidifiez le crâne en appliquant une solution saline stérile pour révéler le MCA gauche. Marquez la branche proximale de l’ACM sur l’os squamosal à l’aide d’un marqueur. Tracez doucement un cercle d’environ 1 mm de diamètre autour de la zone marquée avec la perceuse dentaire pneumatique (réglage de la vitesse de la bavure à 50 % du contrôleur de vitesse), puis amincissez le crâne d’environ 0,2 mm de profondeur sans toucher la dure-mère inférieure. Arrêtez le forage jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’une très fine couche d’os.</li>
	<li>Mélanger la solution de thrombine (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) et de Rose bengal (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) en fonction du poids corporel de la souris. Par exemple, pour une souris de 25 g de poids corporel, mélangez 20 μL de thrombine (0,1 U/μL) et 125 μL de RB (10 mg/mL).</li>
	<li>Injecter lentement la solution T+RB (145 μL par 25 g de poids corporel) dans le sinus rétro-orbitaire à l’aide d’une seringue à insuline (aiguille #31G). NOTA : Dans les expériences pilotes, le taux de mortalité des doses croissantes de thrombine mélangées à la dose standard de colorant RB (50 mg / kg) a été examiné pour la photoactivation. La mortalité était de 0 % pour la thrombine à 80 U/kg (n = 13), de 43 % pour la thrombine à 120 U/kg (n = 7) et de 100 % pour la thrombine à 160 U/kg (n = 5) et à 200 U/kg (n = 5). Une dose de 80 U/kg de thrombine a donc été choisie pour ce modèle. L’imagerie par gabarit laser a également été utilisée pour exclure la possibilité d’une coagulation sanguine rampante près de la cavité orbitaire après l’injection de T+RB dans les sinus rétro-orbitaires (figure supplémentaire 1), ainsi que d’un dépôt généralisé de fibrine dans l’hémisphère controlatéral qui n’a pas été soumis à un éclairage laser (figure supplémentaire 2).</li>
	<li>Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.</li>
	<li>Appliquez l’illuminateur avec une lumière laser de 532 nm (avec une énergie de 0,5 mW) sur le site foré à une distance de 2 pouces pendant 20 minutes. Visualisez l’éclairage sur la branche proximale de l’ACM à l’aide d’un masque de protection laser (Figure 1, C, D). REMARQUE : Le MCA avec un éclairage de 532 nm montre une fluorescence rouge sous les lunettes. L’ACM distale disparaîtra après 10 min d’éclairage. Exclure l’animal si le flux distal de MCA est toujours présent après 20 min d’éclairage.</li>
	<li>Arrêtez l’éclairage laser après 20 min. Fermez la plaie avec des pinces stériles.</li>
</ol>4. Imagerie intravitale (facultatif)
NOTE : Pour caractériser la formation du thrombus in vivo, utiliser l’imagerie intravirale par un disque de spin confocal avec système de photoactivation23.
<ol><li>Faites une fenêtre crânienne de ~3 mm de diamètre sur l’os pariétal du crâne.</li>
	<li>Placez une vitre de protection sur la fenêtre crânienne et localisez le MCA distal (~50 μm de diamètre) sous un objectif d’immersion dans l’eau 20x.</li>
	<li>Étiqueter la plaquette circulante par injection dans la veine caudale d’anticorps anti-GPIbβ conjugué DyLight488 (0,1 mg/kg) à 5 min avant l’imagerie.</li>
	<li>Injecter la solution de mélange de thrombine (80 U/kg) et de Rose bengal (50 mg/kg) par rétro-orbitale à 5 min avant l’imagerie.</li>
	<li>Photoactivez le MCA à l’aide d’un système laser de 561 nm avec un faisceau laser de 10 μm de diamètre et enregistrez l’image jusqu’à la formation du thrombus.</li>
</ol>5. Administration du tPA
<ol><li>Placez l’animal anesthésié sur un tampon chaud à 37 °C. Au moment choisi après la photoactivation, mouillez une gaze avec de l’eau tiède ~45 °C et enroulez-la sur la queue pendant 1 min.</li>
	<li>Injecter du tPA humain recombinant (10 mg/kg) par la veine caudale avec un bolus de 50 % et 50 % pendant 30 min par pompe à perfusion. REMARQUE : Bien que la dose clinique de tPA humain recombinant pour le traitement de l’AVC ischémique aigu soit de 0,9 mg/kg, une dose plus élevée (10 mg/kg) est couramment utilisée chez les rongeurs pour compenser la réduction de la réactivité du tPA entre espèces. Nous avons également suivi le protocole standard d’administration de tPA dans des modèles précliniques d’AVC, en utilisant 50 % comme bolus et 50 % perfusés par la veine caudale pendant 30 minutes.</li>
</ol>6. Surveiller le débit sanguin cérébral (CBF)
REMARQUE : Pour confirmer la récupération du CBF après le traitement par tPA, utilisez un système d’imagerie bidimensionnel par contraste de chatoiementau laser 15 et enregistrez immédiatement après la photothrombose (étape 3.9) ou 24 h après le traitement par tPA.
<ol><li>Placez l’animal anesthésié en position couchée et faites une incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne exposé.</li>
	<li>Hydratez le crâne avec une solution saline stérile et appliquez délicatement le gel à ultrasons sur le crâne. Évitez les cheveux et les bulles dans le gel, qui interféreront avec le signal CBF.</li>
	<li>Surveillez le CBF dans les deux hémisphères cérébraux à l’aide d’un imageur de contraste laser à taches pendant 10 minutes.</li>
	<li>Après avoir enregistré l’image CBF, fermez le cuir chevelu avec de la colle tissulaire et remettez l’animal dans la cage.</li>
	<li>Analysez le CBF dans les régions sélectionnées et calculez le pourcentage de récupération du CBF par rapport à la région controlatérale.</li>
	<li>Ensuite, replacez l’animal dans une cage chaude pour le récupérer. Surveillez les souris pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie. Placez les aliments mouillés dans la cage et rapportez-les à l’établissement de soins aux animaux. REMARQUE : Fournir une analgésie postopératoire comme recommandé par les directives de l’établissement local.</li>
</ol>7. Mesure du volume de l’infarctus par coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC)
<ol><li>Vingt-quatre heures après la photothrombose, anesthésiez profondément l’animal conformément aux directives institutionnelles locales pour la chirurgie de non-survie. REMARQUE : Nous administrons du tribromoéthanol (avertin) 250 mg / kg par injection intrapéritonéale (IP).</li>
	<li>Effectuez une perfusion transcardique avec PBS, collectez du cerveau frais et incorporez-le dans du gel d’agar à 3 %.</li>
	<li>Sectionner la tranche de cerveau de 1 mm d’épaisseur par vibratome et incuber dans une solution à 2% TTC pendant 10 min.</li>
	<li>Quantifier le volume total de l’infarctus à partir de 6 tranches de cerveau en tant que volume absolu par le logiciel ImageJ. REMARQUE : L’œdème cérébral n’a pas été utilisé comme mesure des résultats pour deux raisons. Tout d’abord, la coloration TTC mesure la viabilité tissulaire (via l’activité de réduction mitochondriale) qui est une conséquence plus sévère que l’œdème. Deuxièmement, au fur et à mesure que l’infarctus se déroule, un œdème vasogénique et cytotoxique se produit et ne peut pas être facilement distingué par les méthodes standard de mesure de l’œdème cérébral. Cependant, nous avons utilisé le marquage anti-immunoglobine (IgG) pour évaluer l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), et nous avons trouvé une extravasation d’IgG comparable à 6 h après la photoactivation dans les modèles d’AVC RB et T+RB (Figure 3 supplémentaire).</li>
</ol>8. Mesure de la formation de thrombus
REMARQUE : Pour mesurer la formation du thrombus, prélever le cerveau 1 h et 2 h après la photothrombose pour la mesure du thrombus dans l’ACM par immunochimie (IHC) et pour la mesure de la fibrine dans l’hémisphère cérébral par immunoblot, respectivement.
<ol><li>Effectuer l’IHC pour la caractérisation de la composition du caillot. Fixez le cerveau avec 4 % de paraformaldéhyde pendant la nuit, puis déshydratez le cerveau avec 30 % de saccharose pour l’intégration de l’OCT.</li>
	<li>Sectionnez le cerveau avec une orientation sagittale de 20 μm d’épaisseur et effectuez l’IHC avec des anticorps spécifiques contre le fibrinogène, les plaquettes (glycoprotéine IIb), les globules rouges (TER119) et les vaisseaux sanguins (isolectine GS-IB4).</li>
	<li>Effectuer la mesure de la fibrine dans l’hémisphère cérébral par immunoblot avec un anticorps contre le fibrinogène.</li>
</ol>

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<li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+antiplatelet+therapies%3A+emphasis+on+preserving+haemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li>
<li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+crculation+in+ischemic+stroke%3A+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li>
<li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombsis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’AVC photothrombotique RB traditionnel, introduit en 1985, est un modèle attrayant d’ischémie cérébrale focale pour les interventions chirurgicales simples, la faible mortalité et la reproductibilité élevée de l’infarctus cérébral. 5 Dans ce modèle, le colorant photodynamique RB active rapidement les plaquettes lors de l’excitation lumineuse, conduisant à des agrégats denses qui occlus le vaisseau sanguin 5,8,23.<s...

La thrombectomie endovasculaire et la thrombolyse médiée par tPA sont les deux seules thérapies approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’AVC ischémique aigu, qui touche ~700 000 patients chaque année aux États-Unis1. Étant donné que l’application de la thrombectomie est limitée à l’occlusion des gros vaisseaux (LVO), alors que la thrombolyse tPA peut soulager les occlusions des petits vaisseaux, les deux sont des thérapies précieuses de l’AVC ischémique aigu2. De plus, la combinaison des deux thérapies (p. ex., l’initiation de la thrombolyse tPA dans les 4,5 heures suivant le début de l’AVC, suivie d’une thrombectomie) améliore la reperfusion et les résultats fonctionnels3. Ainsi, l’optimisation de la thrombolyse reste un objectif important pour la recherche sur l’AVC, même à l’ère de la thrombectomie.
Les modèles thromboemboliques sont un outil essentiel pour la recherche préclinique sur l’AVC visant à améliorer les thérapies thrombolytiques. Cela est dû au fait que les modèles d’occlusion vasculaire mécanique (par exemple, l’occlusion MCA de suture intraluminale) ne produisent pas de caillots sanguins et que la récupération rapide du flux sanguin cérébral après l’ablation de l’occlusion mécanique est trop idéalisée 4,5. À ce jour, les principaux modèles thromboemboliques comprennent la photothrombose 6,7,8, l’application topique de chlorure ferrique (FeCl3)9, la micro-injection de thrombine dans la branche MCA 10,11, l’injection ex vivo de (micro)emboles dans le MCA ou l’artère carotide commune (ACC)12,13,14 et l’hypoxie-ischémie transitoire (tHI)15,16, Chapitre 17 et 18. Ces modèles d’AVC diffèrent par la composition histologique des caillots qui en résultent et la sensibilité aux thérapies lytiques médiées par le tPA (tableau 1). Ils varient également en ce qui concerne l’exigence chirurgicale de la craniotomie (nécessaire pour l’injection in situ de thrombine et l’application topique de FeCl3), la constance de la taille et de la localisation de l’infarctus (par exemple, la perfusion d’ACC de microemboles donne des résultats très variables) et les effets globaux sur le système cardiovasculaire (par exemple, l’IHI augmente la fréquence cardiaque et le débit cardiaque pour compenser la vasodilatation périphérique induite par l’hypoxie).
Le modèle d’AVC photothrombotique (PTS) basé sur le colorant RB présente de nombreuses caractéristiques intéressantes, notamment des procédures chirurgicales simples sans craniotomie, une faible mortalité (généralement < 5 %) et une taille et une localisation prévisibles de l’infarctus (dans le territoire fournissant l’ACM), mais il présente deux limites majeures. 8 La première mise en garde est la réponse faible à nulle au traitement thrombolytique médié par le tPA, ce qui est également un inconvénient du modèle FeCl3 7,19,20. La deuxième mise en garde des modèles d’AVC PTS et FeCl3 est que les thrombus qui en résultent sont constitués d’agrégats plaquettaires densément emballés avec une petite quantité de fibrine, ce qui non seulement conduit à sa résilience au traitement tPA-lytique, mais s’écarte également du modèle de thrombus plaquettaire/fibrine mélangés chez les patients ayant subi un AVC ischémique aigu21,22. En revanche, le modèle de thrombine-microinjection in situ comprend principalement de la fibrine polymérisée et une teneur incertaine en plaquettes10.
Compte tenu du raisonnement ci-dessus, nous avons émis l’hypothèse que l’association de RB et d’une dose sous-thrombotique de thrombine pour la photoactivation ciblée par l’ACM à travers un crâne aminci peut augmenter la composante fibrine dans les thrombus résultants et augmenter la sensibilité au traitement lytique médié par tPA. Nous avons confirmé cette hypothèse23 et nous décrivons ici en détail les procédures du modèle d’AVC photothrombotique modifié (T+RB).

<table><tbody><tr><td>Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>infarctus</td></tr><tr><td>4-0 Suture monofilament en nylon</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>fournitures chirurgicales</td></tr><tr><td>5-0 suture en soie</td><td>Harvard Appareil</td><td>624143</td><td>fournitures chirurgicales</td></tr><tr><td>Faisceau laser 543nm</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>photothrombose</td></tr><tr><td>souris mâles adultes</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10~14 semaines (22~30 g)</td></tr><tr><td>Barre d’anesthésie pour adaptateur de souris</td><td>atelier d’usinage,</td><td>configuration chirurgicale</td>UVA <td></td></tr><tr><td>Avertin (2, 2, 2-tribromoéthanol)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>euthanasie</td></tr><tr><td>Foret dentaire</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>configuration chirurgicale</td></tr><tr><td>Microscope numérique</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>imagerie</td></tr><tr><td>cérébrale Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>dispositif chirurgical</td></tr><tr><td>Pince fine incurvée (dentelée)</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine incurvée (lisse)</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>instrument chirurgical</td></tr><tr><td>chèvre anti-lapin Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Immunohistochimie</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito hémostatiques</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>instrument chirurgical</td></tr><tr><td>Pompe à chaleur avec coussin chauffant Pompe à</td> perfusion <td>Gaymar</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion</td><td>KD Scientific</td><td>200</td><td>Traitement thrombolytique</td></tr><tr><td>Seringue à insuline avec aiguille 31G</td><td>BD</td><td>328291</td><td>photothrombose</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>Anesthésie</td></tr><tr><td>Laser de protection google 532nm</td><td>Thorlabs</td><td>LG3</td><td>photothrombose</td></tr><tr><td>Kétoprofène</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>NSAID analgésie</td></tr><tr>micro<td>porte-aiguilles</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>instrument chirurgical</td></tr><tr><td>micro ciseaux</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>instrument chirurgical</td></tr><tr><td>MoorFLPI-2 caméra de flux sanguin</td><td>Moor</td><td>780-nm source laser</td><td>Laser Speckle Contrast</td></tr><tr><td>Imaging Adaptateur souris</td><td>RWD</td><td>68014</td><td>configuration chirurgicale</td></tr><tr><td>Puralube Pommade vétérinaire</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>prévention de la sécheresse oculaire</td></tr><tr><td>Embouts écarteur</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td><td>configuration chirurgicale</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>photothrombose</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td>photothrombose</td></tr><tr><td>Colle tissulaire</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>fournitures chirurgicales</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo activase 2mg</td><td>traitement thrombolytique</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC infacrt</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CCM,</td><td>anesthésie</td> UVA <td></td></tr></tbody></table>

un modèle d’avc photothrombotique enrichi en fibrine et sensible au tpa

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Un modèle idéal d’AVC thromboembolique nécessite certaines propriétés, notamment des procédures chirurgicales relativement simples avec une faible mortalité, une taille et une localisation d’infarctus constantes, une précipitation de caillots sanguins mélangés plaquettaire/fibrine similaires à ceux des patients, et une sensibilité adéquate au traitement fibrinolytique. Le modèle d’AVC photothrombotique à base de colorant rose bengale (RB) répond aux deux premières exigences, mais est hautement réfractaire au traitement lytique médié par le tPA, probablement en raison de sa composition en caillots riche en plaquettes, mais pauvre en fibrine. Nous pensons que la combinaison d’un colorant RB (50 mg/kg) et d’une dose sub-thrombotique de thrombine (80 U/kg) pour la photoactivation visant la branche proximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA) peut produire des caillots enrichis en fibrine et sensibles au tPA. En effet, le modèle de photothrombose combinée à la thrombine et à la RB (T+RB) a déclenché des caillots sanguins mixtes plaquette/fibrine, comme le montrent l’immunomarquage et les immunoblots, et a maintenu des tailles et des emplacements d’infarctus constants ainsi qu’une faible mortalité. De plus, l’injection intraveineuse de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dans les 2 heures suivant la photoactivation a significativement diminué la taille de l’infarctus dans la photothrombose T+RB. Ainsi, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être un modèle expérimental utile pour tester de nouvelles thérapies thrombolytiques.

Tout d’abord, nous avons comparé la teneur en fibrine dans les caillots sanguins induits par la photothrombose RB par rapport à T+RB. Des souris ont été sacrifiées par perfusion transcardique de fixateurs 2 h après la photoactivation, et des cerveaux ont été prélevés pour la coloration par immunofluorescence de la branche MCA dans les plans longitudinaux et transversaux. Dans la photothrombose RB, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41+ et de peu de fibrine (Figure 2</st...

Les modèles traditionnels d’AVC photothrombotique (PTS) induisent principalement des agrégats plaquettaires denses d’une haute résistance au traitement lytique par activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Ici, un modèle PTS murin modifié est introduit en co-injectant de la thrombine et un colorant photosensible pour la photoactivation. Le modèle PTS amélioré par la thrombine produit des caillots mixtes plaquettaire/fibrine et est très sensible à la thrombolyse tPA.

Un modèle d’AVC photothrombotique enrichi en fibrine et sensible au tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Nous voulons créer un modèle d’AVC qui produit un caillot sanguin similaire aux échantillons de patients et qui répond au traitement thrombolytique cliniquement pertinent. Par conséquent, nous modifions le modèle classique de l’AVC photothrombotique et mélangeons la thrombine et le colorant photodynamique rose bengal avant la photoactivation. Nous sommes heureux que cette procédure crée effectivement des caillots sanguins très sensibles à la thrombolyse médiée par le tPA.Ce modèle d’AVC photothrombotique modifié utilisant des procédures chirurgicales très simples avec un faible taux de mortalité a produit une taille et une localisation d’infarctus très constantes. Vous produisez également un caillot sanguin mixte de fibrine et de plaquettes qui est similaire à ceux du patient victime d’un AVC aigu. Par conséquent, nous pensons qu’il est très utile pour la recherche préclinique sur l’AVC de développer des thérapies thrombolytiques plus efficaces.Nous espérons que davantage de personnes utiliseront notre modèle. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Yu-Yo Sun, notre professeur adjoint de recherche dans notre groupe. 30 minutes avant l’intervention, préparez la souris en lui injectant un analgésique.Après avoir anesthésié la souris, effectuez un pincement des orteils pour vous assurer qu’elle est complètement anesthésiée. Retirez ensuite les poils du cou et de la tête gauches avec une crème dépilatoire. Placez la souris sur l’adaptateur pour petit animal en position couchée sur le dos et stérilisez la zone cutanée chirurgicale en l’essuyant avec trois coups alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70 %.Sous un microscope à dissection, faites une incision cervicale gauche de 0,5 centimètre à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite à environ 0,2 centimètre latéralement de la ligne médiane. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces finement dentelées, séparez les tissus mous et le fascia pour exposer le LCCA. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces fines et lisses, séparez soigneusement le LCCA du nerf vagal.Placez une suture permanente à double nœud autour du LCCA à l’aide d’une suture en soie 5-0. Retournez la souris en position couchée et faites pivoter le rouleau du pince-nez de 15 degrés. Stérilisez ensuite la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois coups alternés de bétadine et d’éthanol à 70 %.Faites une incision de 0,8 centimètre dans le cuir chevelu à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite le long de l’œil et de l’oreille gauches pour exposer le muscle temporal. Ensuite, faites une incision de 0,5 centimètre le long du bord du muscle temporal sur l’os pariétal gauche. Ensuite, faites une deuxième incision verticale de 0,3 centimètre sur le muscle temporal et rétractez le muscle pour exposer le bord de l’os pariétal et de l’os squamosal.Assurez-vous de visualiser le point de repère de la suture coronale entre les os frontal et pariétal. Ensuite, humidifiez le crâne en appliquant une solution saline stérile pour révéler le MCA gauche, et marquez la branche proximale du MCA sur l’os squamosal avec un marqueur. Tracez délicatement un cercle d’un millimètre de diamètre autour de cette zone marquée à l’aide d’une perceuse pneumatique.Ensuite, amincissez le crâne d’environ 0,2 millimètre de profondeur sans toucher la dure-mère inférieure. Arrêtez le forage lorsqu’il reste une très fine couche d’os. Ensuite, mélangez la solution de thrombine et de rose bengale en fonction du poids corporel de la souris et injectez lentement le mélange dans le sinus rétro-orbitaire avec une aiguille de calibre 31.Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Appliquez l’illuminateur avec une lumière laser de 532 nanomètres sur le site foré à une distance de deux pouces pendant 20 minutes. Visualisez l’éclairage au niveau de la branche proximale du MCA à l’aide de lunettes de projection laser.Après 20 minutes, arrêtez l’éclairage laser. Faites une fenêtre crânienne de trois millimètres de diamètre sur l’os pariétal du crâne et placez une vitre de protection dessus. Localisez ensuite le MCA distal sous une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x.Étiquetez la plaquette circulante par injection dans la veine caudale de l’anticorps anti-GP1b-bêta conjugué DyLight 488 cinq minutes avant l’imagerie. Ensuite, injectez rétro-orbitalement le mélange de solution de thrombine et de rose bengale. Photoactivez le MCA à l’aide d’un système laser de 532 nanomètres avec un faisceau laser de 10 micromètres de diamètre, et enregistrez l’image jusqu’à la formation du thrombus.Pour l’administration de tPA, placez l’animal anesthésié sur un tampon chaud à 37 degrés Celsius. Enveloppez sa queue d’une gaze humide chaude à 45 degrés Celsius pendant une minute au point de temps post-photoactivation sélectionné. Ensuite, injectez le tPA humain recombinant par la veine caudale.Injectez 50 % en bolus et perfusez les 50 % restants pendant 30 minutes à l’aide d’une pompe à perfusion. Pour surveiller le flux sanguin cérébral, faites une incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne exposé. Hydratez le crâne avec une solution saline stérile et appliquez doucement le gel à ultrasons dessus, en veillant à éviter les poils ou les bulles d’air dans le gel.Surveillez le flux sanguin cérébral dans les deux hémisphères cérébraux sous l’imageur de contraste laser pendant 10 minutes. Le marquage par immunofluorescence montre que dans la photothrombose à base de colorant rose bengale, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41 positives et de peu de fibrine. En revanche, dans la photothrombose thrombine plus rose bengale, la branche MCA a été occluse par des caillots de plaquettes et de fibrine mélangés au hasard.L’analyse par immunotransfert a montré une augmentation de plus de deux fois du dépôt de fibrine dans l’hémisphère ipsilatéral dans la photothrombose de la thrombine et du bengale de rose par rapport à la photothrombose du bengale de rose seule. L’imagerie intravitale au microscope confocal a montré qu’une injection intraveineuse de thrombine ne parvenait pas à induire des agrégats plaquettaires, même sous éclairage laser. Les plaquettes ont formé des caillots homogènes dans le modèle de photothrombose du bengale rose, mais des agrégats inégaux avec de multiples régions faibles dans le modèle de la thrombine et du bengale rose.Le CBF de la même souris avant et 24 heures après le traitement par tPA par rapport au traitement par véhicule a été mesuré par imagerie par contraste de chatoiement laser et normalisé à l’hémisphère controlatéral. Dans la photothrombose du Bengale rose, le traitement par tPA a conduit à une tendance à la récupération du CBF, en particulier dans la zone de la frontière ischémique par rapport aux souris traitées par véhicule. Dans la photothrombose de la thrombine et de la rose bengale, la récupération du CBF chez les souris traitées par tPA était plus importante, et les branches proximales de l’ACM devenaient souvent visibles à 24 heures.Dans la photothrombose du Bengale rose, une taille d’infarctus similaire a été détectée chez des souris traitées par véhicule et traitées par tPA. En revanche, dans la photothrombose de la thrombine et du bengale rose, le traitement lytique tPA a significativement réduit l’infarctus à 0,5, une ou deux heures, mais pas six heures après la photoactivation par rapport aux souris traitées par véhicule, La génération de fibrine médiée par la thrombine est cruciale pour la formation de thrombus dans cette procédure. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la composition des caillots et pour étudier plus en détail les traitements thrombolytiques.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes de traitement par thrombolyse peuvent être appliquées et l’efficacité ultérieure déterminée. L’ajout de thrombine permet d’ajuster la composition du caillot de pauvre en fibrine à riche en fibrine, ce qui permet aux chercheurs de développer des stratégies thérapeutiques cliniquement pertinentes.

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