Visualisation de l’innervation immunoréactive du peptide lié au gène de la calcitonine du dura mater crânien de rat avec immunofluorescence et traçage neuronal

Ce protocole peut fournir une référence méthodologique variable pour comprendre la structure neurovascular compliquée du mater crânien de dura sur l’état physiologique ou pathologique. Profitant de la monter de dura de montage entière transparente, la corrélation spatiale des fibres nerveuses immunoréactives dural CGRP et des vaisseaux sanguins peut être démontrée dans une vue 3D. Après euthanasier un rat, perfusé transcardiaquement avec 100 millilitres de solution saline normale à 0,9%, suivis de 250 à 300 millilitres de paraformaldéhyde à 4% dans un tampon phosphate molaire 0,1.

Lorsque vous avez terminé, retirez la peau de la tête et ouvrez le crâne pour exposer la dura mater et la face dorsale du cerveau. Disséquer le mater crânien de dura le long du tronc cérébral au bulbe olfactif dans un modèle entier de montage. Rincer le mater crânien dans un tampon phosphate molaire 0,1 pendant environ une minute et l’incuber dans une solution bloquante.

Transférer le dura mater dans l’anticorps anti-CGRP de souris pendant la nuit. Le lendemain, laver la dura mater trois fois dans un tampon phosphate molaire 0,1. Incuber le dura mater dans une solution mixte d’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 anti-souris et de phalloïde 568 dans 0,1.

Tampon phosphate molaire contenant 1% sérum d’âne normal et 0,5% Triton X-100 pendant 1,5 heure à température ambiante. Ensuite, lavez le dura mater trois fois dans un tampon phosphate molaire 0,1, coupez les bords et montez-le sur des lames de microscope. Mettez sur les glissades de couverture avec 50% de glycérine avant l’observation.

Imaginez l’ensemble de la monture dura mater avec un microscope fluorescent, puis prenez des images des fibres nerveuses immunoréactives cgrp et des vaisseaux sanguins marqués à la phalloïde dans la douma à l’aide d’un microscope confocal. Rasez la tête du rat avec un rasoir électrique, puis mettez des barres d’oreille émoussées au rat et placez-la sur le dispositif stéréotaxique. Placez le porte-bouche et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.

Nettoyez le côté chirurgical de la peau de la tête à l’aide d’éthanol à 75% et faites une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Retirez carrément le périoste et les tissus musculaires du crâne à l’aide d’applicateurs stériles à bout de coton. Percez un petit trou à l’aide d’une perceuse à bavure avec un mors rond sur les os pariétal et temporal gauches au-dessus de l’artère méningée moyenne.

Construisez une berge autour du trou avec du ciment de silicate dentaire et ajoutez deux microlitres de fluorogold dans le trou autour de l’artère méningée moyenne avec un microsyringe de 10 microlitres. Couvrez le trou avec un petit morceau d’éponge hémostatique. Mettez un morceau de film de paraffine sur le trou et scellez les bords avec de la cire d’os.

Suturer la plaie avec du fil stérile. Gardez les rats dans une zone chaude jusqu’à ce qu’ils aient complètement récupéré. Ensuite, retournez les rats dans leurs cages.

Après sept jours de survie, perfuser ces rats avec la solution saline normale de 0,9% suivie du paraformaldéhyde de 4% dans le tampon molaire de phosphate de 0,1. Disséquer le TG et cervical un à quatre DRG, puis les couper à l’épaisseur de 30 micromètres sur un système de microtome cryostat dans la direction sagittale. Et montez les sections sur des lames de verre revêtues de silane.

Encerclez les sections avec un stylo histochimique et incuber pendant 30 minutes dans une solution de blocage. Transférer les échantillons dans la solution d’anticorps anti-fluorogold de lapin et d’anticorps anti-CGRP de souris et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez les sections trois fois dans un tampon phosphate molaire 0,1.

Incuber les sections lavées dans une solution mixte d’anticorps secondaire anti-lapin Alexa Fluor 594 et d’anticorps secondaire anti-souris Alexa Fluor 488. Ensuite, lavez-les trois fois dans un tampon phosphate molaire 0,1 et appliquez des bordereaux de couverture avec 50% de glycérine pour observation. Prenez des images des neurones marqués par le fluorogold dans TG et DRG sous éclairage UV à l’aide d’un microscope fluorescent.

Ensuite, capturez des images des neurones marqués fluorogold et CGRP dans TG et DRGs. Après la souillure histochimique immunofluorescente et fluorescente avec CGRP et le phalloïdine, des fibres nerveuses immunoreactive de CGRP et le phalloidin ont marqué des artérioles dural et des tissus conjonctifs ont été clairement visualisés dans tout le mater crânien entier de dura de montage dans un modèle 3D. Les fibres nerveuses immunoreactives épaisses et minces de CGRP fonctionnent parallèlement aux artères dural autour de la paroi vasculaire ou entre les vaisseaux sanguins.

Pendant sept jours après application de fluorogold sur la région de l’artère méningitique moyenne et du mater crânien de dura de rat, les neurones marqués par fluorogold ont été détectés dans le TG et les DRGs cervicaux du côté ipsilateral de l’application de traceur, qui a été directement observée sous l’illumination UV de la microscopie fluorescente. Des neurones marqués par Fluorogold ont été trouvés dans chacun des trois branches de TG, avec des concentrations plus élevées sur les divisions ophtalmiques et maxillaires et avec des concentrations plus faibles sur la division mandibulaire. Certains des neurones marqués par le fluorogold ont également été observés dans les deux à trois DRG cervicaux.

Ces photographies représentatives de double immunofluorescence montrent des neurones sensoriels dans TG et DRG. Les neurones marqués avec FG, CGRP, et FG et CGRP ont été visualisés par double immunofluorescence. Lorsque vous tentez ce protocole, n’oubliez pas de disséquer complètement le mater crânien dura et de le coller sur une lame dans un motif de montage entier.