Transplantation intramyocardique d’hydrogels injectables à chargement MSC après l’infarctus du myocarde dans un modèle murin

Cette méthode peut aider à résoudre des problèmes clés dans la thérapie cardiaque exacerbée actuelle, tels que la faible applicabilité à une faible rétention et à la survie des cellules transplantées dans les cœurs infarctus. Pour résoudre ce problème, cette méthode peut fournir une technique fiable pour étudier la transplantation intramyocardique avec des cellules souches à l’aide d’hydrogels injectables dans un modèle murin, qui est une excellente plate-forme à utiliser pour étudier la réparation et la régénération du tissu cardiaque après une infraction myocardique. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode réalisable pour améliorer la rétention et la survie des cellules souches transplantées après une transplantation intra-myocardique en utilisant des hydrogels injectables in situ cross-link cover.

Ces hydrogels offrent diverses possibilités pour l’ingénierie tissulaire cardiaque, telles que l’administration non seulement de cellules souches, mais aussi de facteurs de croissance, de matériel génétique et de médicaments pour maximiser leur effet thérapeutique dans les tissus cardiaques infarctus. Eunmi Lee, une technologue de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure d’expérience in vitro. Les technologues de recherche Eun-Hye Park et Eunhwa Seong feront la démonstration de la procédure pour les expériences in vivo.

Cultivez des cellules souches mésenchymateuses, ou CSM, dans une boîte de culture de 100 millimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, lavez la vaisselle deux fois avec du DPBS et incuberez-les avec un millilitre de substitut de trypsine à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ajoutez ensuite neuf millilitres de milieu de culture aux cellules et centrifugez-les à 500 fois G pendant trois minutes.

Jetez le surnageant obtenu. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS et maintenez la suspension cellulaire sur de la glace. Diluez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu de trypan et déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.

Remettez les CSM en suspension à une densité de un fois 10 à la septième cellule par millilitre et transférez-les dans un tube d’un millilitre. Préparez une solution conjuguée à 6,25 % de GH dans du PBS et séparez-la en deux flacons. Ensuite, mélangez les solutions de GH avec soit six microgrammes par millilitre de HRP, soit 0,07 % de peroxyde d’hydrogène.

Centrifugez brièvement la suspension cellulaire à 1000 fois G et aspirez soigneusement le surnageant résultant. Mélangez ensuite la pastille cellulaire avec la solution de GH A.Chargez les CSM dans la solution de GH A et la solution de GH B de chaque côté d’une seringue double. Plaque de 300 microlitres des solutions GH combinées avec des CSM à une densité finale de 5 millions de cellules par millilitre sur une lame de chambre à huit puits.

Après la formation in situ de l’hydrogel et l’encapsulation ultérieure des CSM par réticulation enzymatique, ajoutez 700 microlitres de DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de solution antimycosique antibiotique. Incuber la lame à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone et remplacer le milieu de culture tous les deux à trois jours. Avant l’opération, dépolissez la poitrine de la souris à l’aide d’une crème dépilatoire et stérilisez la peau avec de l’iode.

Placez la souris sur une table d’opération et intubez-la en insérant un cathéter dans la trachée pour fournir de l’oxygène supplémentaire via une ventilation mécanique. Coupez doucement la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Pénétrez ensuite les muscles intercostaux avec des micro-ciseaux.

Séparez les deuxième et troisième côtes gauches à l’aide d’une suture en soie 5-O pour maintenir une cavité thoracique ouverte. Ligaturez soigneusement l’artère coronaire descendante antérieure gauche à l’aide d’un porte-aiguille avec un 8-0 suture en polypropylène et coupe la suture à l’aide d’électrocautérisation. Observez un changement de couleur immédiat de la paroi ventriculaire antérieure gauche.

Après avoir induit l’infarctus du myocarde, injectez 10 microlitres de solutions de charge GH MSC en deux points différents de la zone frontalière de l’infarctus. Restaurez la cavité thoracique ouverte et fermez les muscles et la peau à l’aide de sutures 5-0. Retirez le tube trachéal et placez la souris dans une cage sous une lampe infrarouge pendant la récupération.

Effectuez une échocardiographie et mesurez les lignes correspondantes pour la paroi antérieure du VG, l’interne du VG et la paroi postérieure du VG afin d’obtenir l’épaisseur de la paroi cardiaque, la dimension de la chambre et le raccourcissement fractionné. Avant la transplantation in vivo, la prolifération et la survie des CSM dans les hydragels GH ont été confirmées par un test de coloration 3D in vitro de cellules mortes vivantes. Des images représentatives ont montré une prolifération suffisante de MSC montrant des réseaux ramifiés au sein des hydrogels GH.

Une structure multicellulaire 3D étendue des CSM a été clairement observée au jour 14, indiquant que les hydrogels de GH pourraient fournir un microenvironnement approprié pour les cellules encapsulées. Après l’induction de l’infarctus du myocarde, des hydrogels de GH chargés par MSC ont été transplantés par voie intramyocardique dans les zones péri-infarctus. Les CSM et le gel ont été maintenus de manière appropriée dans la région infarctus.

Les CSM étaient bien intégrées dans les hydrogels de GH. Pour vérifier les effets thérapeutiques des hydrogels de GH de charge MSC, les modifications de la fonction et de la structure cardiaques ont été évaluées par échocardiographie et analyse histologique au jour 28 après la transplantation, et comparées entre les différents groupes de traitement. L’échocardiographie représentative a montré une amélioration des fonctions cardiaques, y compris le raccourcissement fractionnel, la fraction d’éjection et le volume systolique final dans le groupe traité par gel MSC.

De plus, l’analyse histologique a montré moins de fibrose, des parois infarctus plus épaisses et une taille d’infarctus plus petite dans le groupe traité par gel MSC que dans les autres groupes, ce qui indique que ce protocole a considérablement atténué le remodelage du VG. En utilisant cette technique, nous avons obtenu des cellules souches à long terme dans et la prolifération et avons conduit à une amélioration significative de la structure et de la fonction cardiaques après un infarctus du myocarde dans un modèle murin. Cette technique peut être étendue pour être utilisée chez les grands animaux et à l’application clinique en tant que nouvelle stratégie de prévention de l’insuffisance cardiaque post-infarctus en assurant la réparation et la régénération du tissu cardiaque.