Name: Fractionnement asymétrique de flux de champ-flux pour le dimensionnement des nanoparticules d’or dans la suspension (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez la fractionnement asymétrique de flux de champ-flux (AF4) couplé à la détection UV-vis pour déterminer la distribution de taille des nanoparticules d'or en suspension. Cette méthode analytique polyvalente permet de caractériser précisément des échantillons complexes.

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Les auteurs remercient l’ensemble du consortium ACEnano pour des discussions fructueuses à toutes les étapes de la préparation du protocole présenté ici. Les auteurs apprécient également le financement du programme Horizon 2020 de l’Union européenne (H2020) dans le cadre de l’accord de subvention nº 720952 dans le cadre du projet ACEnano.

Tous les auteurs de ce manuscrit sont des employés de Postnova Analytics GmbH, dont les produits sont utilisés dans ce protocole.

La taille hydrodynamique d’un AuNP inconnu a été évaluée avec précision par AF4 couplée à un détecteur UV-vis utilisant des normes bien définies de taille d’AuNP s’étendant de 20 nm à 100 nm. La méthode AF4 développée a été optimisée à l’aide d’un profil de flux croisé constant afin d’établir une relation linéaire entre le temps de rétention mesuré et la taille auNP, permettant ainsi une détermination de taille simple à partir de l’analyse linéaire de régression. Un accent particulier a également été mis sur la réalisation de taux de récupération suffisamment élevés indiquant qu’il n’y avait pas de perte significative d’échantillon pendant la fractionnement, et que la méthode AF4 développée, y compris l’élixent appliqué et la membrane, correspondait bien à tous les échantillons fractionnés d’AuNP.
Le développement de la méthode est sans doute l’étape la plus critique de l’AF4 et plusieurs paramètres, y compris les dimensions du canal, les paramètres d’écoulement ainsi que les propriétés eluent, membrane, espaceur, et même l’échantillon doivent être pris en compte afin d’améliorer la fractionnement dans une fenêtre de temps d’élitution donnée. Le but de ce paragraphe est de guider le lecteur à travers les étapes critiques qui ont été optimisées pour déterminer avec succès la taille de l’échantillon inconnu auNP discuté ici. Pour une description plus détaillée de la façon de développer généralement une méthode AF4, le lecteur est référé à la section AF4 de 'ISO/TS21362:2018 - Nanotechnologies - Analyse des nano-objets utilisant le flux asymétrique et la fractionnement centrifuge du flux de champ'25. En regardant de plus près les conditions de fractionnement appliquées données dans le tableau 3,la première étape critique est l’introduction et l’assouplissement de l’échantillon AuNP dans le canal AF4. Cette étape est régie par le flux d’injection, le flux de mise au point et le flux croisé, dont l’interaction oblige l’échantillon à se localiser près de la surface de la membrane et à le concentrer dans une bande étroite près du port d’injection du canal AF4 définissant essentiellement le point de départ de la fractionnement. Un assouplissement suffisant de l’échantillon est obligatoire car au cours de cette étape, les constituants de l’échantillon de différentes tailles se trouvent dans différentes hauteurs du canal AF4, fournissant ainsi la base d’une fractionnement de taille réussie. La relaxation incomplète de l’échantillon est habituellement visible par une zone de pic de vide accrue résultant de constituants d’échantillons non retainés (c.-à-d. non détendus). Cet effet peut être atténué en augmentant le temps d’injection et/ou le débit croisé appliqué. Toutefois, les deux paramètres doivent être soigneusement analysés, en particulier pour les échantillons sujets à l’agglomération et à l’adsorption sur la membrane AF4, et peuvent être surveillés par les taux de récupération respectifs obtenus pour différents paramètres36,37. Le temps d’injection appliqué de 5 min ainsi qu’un débit croisé de 1,0mL-min-1 ont révélé des taux de récupération >80% pour tous les échantillons d’AuNP et une zone de pointe vide négligeable indiquant des conditions de relaxation quasi optimales. Après un relâchement suffisant de l’échantillon AuNP, le flux de mise au point a été arrêté et le transport de l’échantillon le long de la longueur du canal AF4 jusqu’au détecteur uv-vis respectif a été lancé, ce qui représente la deuxième étape critique. Afin d’assurer une puissance de fractionnement suffisamment élevée à des temps d’analyse raisonnables, un débit croisé constant de 1,0mL-min-1 pendant 30-50 min (selon la norme de taille AuNP fractionnée respective) suivi d’une décomposition linéaire du débit croisé de 10 min à un débit de détecteur de 0,5 mL.min-1 a été appliqué. L’utilisation d’un profil de flux croisé constant à travers la séparation de toutes les normes de taille AuNP a révélé une relation linéaire entre le temps de rétention et la taille auNP suivant la théorie de la FFF22, permettant ainsi la détermination de la taille de l’échantillon auNP inconnu par une simple analyse linéaire de régression. Cependant, des profils autres qu’un flux croisé constant ont également été exploités pour le dimensionnement des nanoparticules, conduisant finalement à une relation non linéaire entre le temps de rétention et la tailledes particules 38,39. En outre, la détermination de la taille en AF4 à l’aide de normes de taille bien définies ne se limite pas à l’AuNP, mais peut également être appliquée aux nanoparticules avec d’autres tailles et composition élémentaire (p. ex.,argent 38,40 ou nanoparticules de silice41,42). En outre, lorsque vous travaillez avec des échantillons dilués, ICP-MS est un détecteur élémentaire très sensible, qui peut être couplé avec AF4, ajoutant à la polyvalence de cette approche analytique pour le dimensionnement d’une grande variété de nanoparticules en suspension.
En dépit de son application répandue, l’étalonnage de taille externe utilisant des normes de taille bien définies dans AF4 a quelques particularités qui doivent être considérées en l’utilisant pour le dimensionnement précis des échantillons inconnus. Tout d’abord, elle repose fortement sur l’application de conditions comparables lors de la fractionnement des normes de taille respectives et de l’échantillon réel. Dans le cas présenté ici, il est donc obligatoire que les normes de taille AuNP ainsi que l’échantillon auNP inconnu soient fractionnés selon la même méthode AF4 ainsi que la même membrane élitente et la même membrane rendant cette approche assez rigide. De plus, comme il n’y a pas de détecteurs sensibles à la taille, par exemple, la diffusion de la lumière (MALS et DLS) à portée de main, il est difficile de déterminer si une méthode AF4 respective utilisant des normes de taille fonctionne suffisamment bien ou non. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons inconnus qui présentent des distributions de très grande taille, où il n’est pas clair si tous les constituants de l’échantillon suivent le modèle normal d’élitution : fractionnement des particules plus petites à plus grosses, ou si les constituants d’échantillons plus gros s’élit déjà en mode stérique-hypercouche, co-exonérer ainsi potentiellement avec les constituants del’échantillon plus petits 43,44. En outre, même si la théorie de la FFF souligne que l’AF4 se sépare uniquement en fonction des différences de taille hydrodynamique avec des particules considérées comme des masses de points sans aucune interaction avecleur environnement 22, la réalité raconte une histoire différente avec les interactions particules-particules et membranes de particules (telles que l’attraction/répulsion électrostatique ou l’attraction van-der-Waals) peut jouer un rôle considérable et peut potentiellement introduire un biais mesurable dans les déterminations de taille par l’intermédiaire de l’étalonnage de tailleexterne 45,46. Il est donc recommandé d’utiliser des normes de taille qui correspondent idéalement à la composition et aux propriétés de surface (potentiel Zeta) de la particuled’intérêt 40,42 ou, si elles ne sont pas disponibles, utilisez au moins des normes de taille de particules bien caractérisées (p. ex., particules de latex de polystyrène) et évaluez soigneusement leur comparabilité avec la particule d’intérêt, en particulier en ce qui concerne leur potentiel zeta de surface dans l’environnement respectif, dans lequel l’analysedoit être effectuée 41,47.
La polyvalence d’AF4 est souvent considérée comme sa plus grande force, car elle offre une gamme d’applications qui va au-delà de la plupart des autres techniques de dimensionnementcourantes dans ce domaine 22,48,49. Dans le même temps, en raison de sa complexité probable associée, il peut également être considéré comme son inconvénient le plus important en particulier contre les techniques de dimensionnement rapide et apparemment facile à utiliser telles que DLS, Nanoparticle Tracking Analysis, ou une seule particule ICP-MS. Néanmoins, lors de la mise en perspective de l’AF4 avec ces techniques de dimensionnement populaires, il devient clair que toutes les techniques ont leurs avantages et leurs inconvénients, mais toutes contribuent à une compréhension plus complète de la nature physico-chimique des nanoparticules et devraient donc être considérées comme complémentaires plutôt que compétitives.
La procédure d’exploitation standard (SOP) présentée ici, met en évidence l’excellente applicabilité d’AF4-UV-vis avec étalonnage de taille externe pour le dimensionnement d’un échantillon auNP inconnu en suspension et a finalement été appliquée comme une ligne directrice recommandée pour l’analyse AF4 d’un échantillon inconnu auNP dans le cadre d’une comparaison interlaboratoire internationale (ILC) qui a été menée dans le cadre du projet Horizon 2020, ACEnano (le résultat de cette CIT fera l’objet d’une future publication). Ce protocole s’ajoute donc aux efforts internationaux encourageants et continus pour valider et normaliser les méthodologies AF425,50,51,52 soulignantle potentiel prometteur de l’AF4 dans le domaine de la caractérisation des nanoparticules.

Les nanoparticules d’or (AuNP) sous forme d’or colloïdal faisaient partie de la culture humaine bien avant qu’il n’y ait une compréhension de ce qu’étaient les nanoparticules et avant que le terme nanoparticule n’ait trouvé son chemin dans le vocabulaire scientifique contemporain. Sans connaissance distincte de leur apparence nanométrique, suspendu AuNP avait déjà été utilisé à des fins médicales et autres dans la Chine ancienne, l’Arabie et l’Inde dans les V-VI sièclesavant JC 1, et aussi les Anciens Romains ont profité de leur couleur rouge rubis pour tacher leur poterie célèbre dans l’exposition Lycurgus Cup au British Museum2. Dans le monde occidental, au cours des siècles du Moyen Age à l’ère moderne, l’AuNP suspendu a été principalement utilisé comme colorants pour le verre et l’émail (Violet de Cassius)3 ainsi que pour traiter une variété de maladies (Eau potable), en particulier la syphilis4.
Cependant, toutes ces études avaient principalement porté sur l’application de l’AuNP suspendu et c’était à Michael Faraday en 1857 d’introduire la première approche rationnelle pour étudier leur formation, leur nature ainsi que leurs propriétés5. Bien que Faraday était déjà conscient que ces AuNP doivent avoir des dimensions très infimes, ce n’est qu’au développement de la microscopie électronique lorsque des informations explicites sur leur distribution de taille ont été accessibles6,7, permettant finalement la corrélation entre la taille et d’autres propriétés auNP.
Aujourd’hui, grâce à leur synthèse assez simple et simple, à leurs propriétés optiques remarquables (résonance plasmon de surface), à leur bonne stabilité chimique et donc à leur toxicité mineure ainsi qu’à leur grande polyvalence en termes de tailles disponibles et de modifications de surface, AuNP a trouvé des applications répandues dans des domaines tels que la nanoélectronique8,le diagnostic9,la thérapie contre le cancer10,ou la livraisonde médicaments 11. Évidemment, pour ces applications, une connaissance précise de la taille et de la répartition de la taille de l’AuNP appliqué est une condition préalable fondamentale pour assurer une efficacitéoptimale 12 et il y a une demande substantielle d’outils robustes et fiables pour déterminer ce paramètre physico-chimique crucial. Aujourd’hui, il existe une pléthore de techniques analytiques capables de dimensionner auNP en suspension, y compris, par exemple, spectroscopie UV-vis (UV-vis)13, diffusion dynamique de lumière (DLS)14 ou spectrométrie de masse plasmatique couplée à particules simples (spICP-MS)15 avec fractionnement de champ-flux (FFF) étant un acteur clé dans ce domaine16,17,18,19,20.
Conceptualisée pour la première fois en 1966 par J. Calvin Giddings21, la FFF comprend une famille de techniques de fractionnement à base d’élitution, où la séparation se déroule dans un mince canal en forme de ruban sans phase stationnaire22,23. Dans fff, la séparation est induite par l’interaction d’un échantillon avec un champ de force externe qui agit perpendiculairement à la direction d’un flux de canal laminaire, dans lequel l’échantillon est transporté en aval généralement vers des détecteurs en ligne respectifs. Parmi ces techniques de FFF connexes, la fractionnement asymétrique du flux de champ d’écoulement (AF4), où un deuxième flux (flux croisé) agit comme le champ de force, est devenu le sous-type24 le plus largement utilisé. En AF4, le fond du canal (mur d’accumulation) est équipé d’une membrane d’ultrafiltration semi-perméable capable de retenir l’échantillon tout en permettant au flux trans traverser la membrane et de quitter le canal via une prise supplémentaire. Par ce moyen, le flux croisé peut pousser l’échantillon vers la paroi d’accumulation, contrecarrant ainsi son flux induit par la diffusion (mouvement brownien). Dans un équilibre résultant des flux induits par le champ et la diffusion ; les constituants d’échantillons plus petits présentant des coefficients de diffusion plus élevés s’alignent plus près du centre du chenal, tandis que les constituants de l’échantillon plus gros présentant des coefficients de diffusion inférieurs se situent plus près du mur d’accumulation. En raison du profil d’écoulement parabolique à l’intérieur du chenal, les constituants de l’échantillon plus petits sont donc transportés dans la laminée plus rapide du flux du canal et s’élit avant les constituants de l’échantillon plus gros. En utilisant le paramètre de rétention fff et les équations du coefficient de diffusion Stokes-Einstein, le temps d’élitution et, respectivement, le volume d’élitution, d’un échantillon en AF4 peuvent ensuite être directement traduits dans sa taille hydrodynamique22. Ici, le comportement d’élitution décrit se réfère au mode d’élitution normal et est généralement valable pour AF4 dans une gamme de taille de particule entre environ 1-500 nm (parfois jusqu’à 2000 nm selon les propriétés des particules et les paramètres de fractionnement) tandis que l’élitution stérique-hypercouche se produit généralement au-dessus de ce seuilde taille 25.
Il existe trois façons courantes d’obtenir des informations sur la taille après la séparation par la FFF. Puisque fff est un instrument modulaire, il peut être combiné en aval avec de multiples détecteurs tels que les détecteurs de diffusion de lumière sensibles à la taille basés sur le principe de la diffusion de lumière multi-angle (MALS)26,27, diffusion dynamique de lumière (DLS)28,29, ou même une combinaison des deux pour obtenir des informations supplémentaires de forme30,31. Toutefois, étant donné que le comportement de rétention d’un échantillon dans un canal FFF est généralement régi par des forces physiques bien définies, la taille peut également être calculée à l’aide d’une approche mathématique (théorie de la FFF), où un simple détecteur de concentration (p. ex., un détecteur uv-vis) est suffisant pour indiquer la présence d’un échantillon32,33.
Comme troisième option, nous rapportons ici l’application d’un étalonnage externe de taille34,35 utilisant des normes bien définies d’AuNP dans la gamme de taille de 20-100 nm pour dimensionner un échantillon inconnu de nanoparticules d’or en suspension utilisant AF4 couplé avec la détection UV-vis. Cette simple configuration expérimentale a été choisie exprès pour permettre au plus grand nombre possible de laboratoires de rejoindre une comparaison interlaboratoire internationale (CIT), qui a ensuite été réalisée dans le cadre du projet ACEnano horizon 2020 de l’Union européenne sur la base du protocole présenté ici.

<table><tbody><tr><td>0,1 et micro ; m Filtres à membrane (PVDF hydrophile)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>Utilisé pour la filtration de solutions aqueuses</td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m Filtre à seringue en PVDF (d = 33 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>Durapore Millex</td><td>Utilisé pour la filtration des pipettes à volume réglable NovaChem100</td></tr><tr><td>(1000 & micro ; L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Research Plus</td><td>Utilisé pour préparer des suspensions AuNP diluées</td></tr><tr><td>Cartouche AF4</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - AF4 Canal analytique</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit AF4</td></tr><tr><td>Membrane - Cellulose régénérée (10 kDa MWCO)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Balance analytique (précision de 0,1 mg)</td><td>Sartorius</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>Utilisé pour peser les granulés SDS et NaOH pour la préparation de la solution de nettoyage</td></tr><tr><td>Passeur d’échantillons automatiques</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr> Four <tr><td>à canaux</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Module Crossflow</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF</td><td>Module de commande Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Pointes de pipette jetables (1000 &micro ; L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>Utilisé pour la préparation de suspensions d’AuNP diluées</td></tr><tr><td>Flacons (par exemple d’un volume de 2 litres)</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>Utilisé pour le stockage d’éluants</td></tr><tr><td>Focus Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Flacons en verre (par exemple volume de 1,5 ml)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>Utilisé pour le stockage d’échantillons</td></tr><tr><td>Étalons de taille des nanoparticules d’or (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>50 mg L-1 chacun, utilisé pour établir la fonction d’étalonnage de la taille</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>Utilisé pour accélérer la dissolution des pastilles SDS et NaOH dans l’ordinateur</td></tr><tr><td>personnel (PC) UPWdell</td> <td>Technologies</td><td>/</td><td>Unité de contrôle des cycles AF4, d’enregistrement et d’évaluation des données collectées, pour les exigences matérielles et logicielles nécessaires, le lecteur est renvoyé au manuel Postnova AF2000</td></tr><tr><td>Équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, lunettes, etc.)</td><td>/</td><td>/</td><td>Selon le laboratoire concerné règles de sécurité pour travailler avec des produits chimiques, y compris des nanomatériaux manufacturés</td></tr><tr><td>Bouchon à vis pour flacons en verre (par exemple, volume de 1,5 ml)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>Utilisé pour le stockage d’échantillons</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS), &ge ; 99 %, Grade buvard</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG</td><td>2326.1</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution de nettoyage</td></tr><tr><td>Granulés d’hydroxyde de sodium (NaOH), &ge ; 98 %, p.a</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG</td><td>6771.1</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution de nettoyage</td></tr><tr><td>Progiciel pour la commande et l’acquisition de données</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Logiciel NovaFFF AF2000</td><td>Logiciel pour l’exécution d’Af4 et l’acquisition de données, pour les exigences matérielles et logicielles nécessaires, le lecteur est renvoyé au manuel Postnova AF2000</td></tr><tr><td>Progiciel pour l’évaluation des données</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Logiciel</td> <td>NovaAnalysisLogiciel pour l’évaluation des données AF4, pour les exigences matérielles et logicielles nécessaires, le lecteur est renvoyé au manuel Postnova NovaAnalysis</td></tr><tr><td>Progiciel pour le traitement final des données</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>Utilisé pour le traitement final des données</td></tr><tr><td>Solvent Degasser</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Sélecteur de solvant</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Organisateur de solvants</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Mélange de tensioactifs</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>Mélange de différents tensioactifs et sels utilisés pour la préparation de l’éluant</td></tr><tr><td>Pompe à pointes</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>Composant de la configuration AF2000 MF - MultiFlow FFF, qui est décrit comme le système AF4 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Échantillon AuNP inconnu</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC60</td><td>60 nm Échantillon AuNP utilisé pour la détermination de la taille via la fonction d’étalonnage de la taille</td></tr><tr><td>Détecteur UV-vis</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN3211</td><td>Pour le couplage en aval avec le système AF4</td></tr><tr><td>Unité de filtration sous vide</td> Système de <td>filtration d’éluants</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Utilisé pour garantir un faible bruit de fond de particules et l’élimination de l’air dissous dans les éluants utilisés afin d’assurer des conditions de fractionnement AF4 optimales</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Utilisé pour l’homogénéisation des suspensions d’AuNP dilué</td></tr><tr><td>Système de purification de l’eau</td><td>Merck Millipore</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>Utilisé pour générer de l’eau ultrapure (UPW, 18.2 M&Omega ; pour la préparation de la solution de nettoyage, des éluants et la dilution des suspensions AuNP</td></tr></tbody></table>

fractionnement asymétrique de flux de champ-flux pour le dimensionnement des nanoparticules d’or dans la suspension

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

La taille des particules est sans doute le paramètre physico-chimique le plus important associé à la notion de nanoparticule. Une connaissance précise de la taille et de la taille de la distribution des nanoparticules est de la plus haute importance pour diverses applications. La gamme de taille est également importante, car elle définit le composant le plus « actif » d’une dose de nanoparticules.
La fractionnement asymétrique de flux de champ-flux (AF4) est une technique puissante pour le dimensionnement des particules en suspension dans la gamme de taille d’environ 1-1000 nm. Il existe plusieurs façons de tirer des informations de taille d’une expérience AF4. Outre le couplage af4 en ligne avec des détecteurs sensibles à la taille basés sur les principes de diffusion de la lumière multi-angles ou de diffusion dynamique de la lumière, il est également possible de corréler la taille d’un échantillon avec son temps de rétention en utilisant une approche théorique bien établie (théorie de la FFF) ou en le comparant avec les temps de rétention des normes bien définies de taille des particules (étalonnage de la taille externe).
Nous décrivons ici le développement et la validation interne d’une procédure d’exploitation standard (SOP) pour le dimensionnement d’un échantillon inconnu de nanoparticules d’or par AF4 couplé avec la détection UV-vis utilisant l’étalonnage externe de taille avec des normes de nanoparticules d’or dans la gamme de taille de 20-100 nm. Cette procédure fournit une description détaillée du flux de travail développé, y compris la préparation de l’échantillon, la configuration et la qualification des instruments AF4, le développement de la méthode AF4 et la fractionnement de l’échantillon inconnu de nanoparticules d’or, ainsi que la corrélation des résultats obtenus avec l’étalonnage de taille externe établi. Le SOP décrit ici a finalement été validé avec succès dans le cadre d’une étude de comparaison interlaboratoire mettant en évidence l’excellente robustesse et la fiabilité de AF4 pour le dimensionnement des échantillons nanoparticulés en suspension.

Tout d’abord, les normes de taille auNP ont été fractionnées par AF4 et détectées par UV-vis mesurant l’absorption de l’AuNP à une longueur d’onde de 532 nm (résonance plasmon de surface d’AuNP). Une superposition des fractogrammes obtenus est présentée à la figure 1. Les temps de rétention de chaque AuNP à son maximum de pointe UV-vis respectif obtenu à partir des mesures de triplicate sont énumérés dans le tableau 5. L’écart type relatif de tous les temps de rétention était inférieur à 1,1 %, avec une variation de mesure décroissante avec une taille croissante. Dans l’ensemble, une excellente répétabilité a été obtenue. Une force de séparation constante a été appliquée, qui a eu comme conséquence une relation linéaire du temps d’elution et de la taille hydrodynamique. La ligne d’étalonnage de taille externe a été établie en traçant le rayon hydrodynamique spécifié par rapport au temps vide corrigé temps d’élitution (temps net de rétention). Une analyse linéaire de régression a donné lieu à une fonction d’étalonnage linéaire avec une interception a = -3,373 nm ± 1,716 nm et une pente b = 1,209 nm-min-1 ± 0,055 nm-min-1. Le comportement linéaire de l’élitution a été confirmé avec un coefficient de corrélation au carré R2 de 0,9958. La fonction d’étalonnage respective est affichée visuellement dans la figure 2.
La deuxième partie portait sur l’analyse de l’échantillon inconnu d’AuNP. Trois aliquots de l’échantillon ont été préparés selon la procédure décrite dans la section du protocole(article 4.2). Chacun des trois aliquots a été étudié en triplicate en utilisant la même méthode de fractionnement AF4 qui a également été appliquée pour les normes de taille AuNP. Les neuf fractogrammes AF4-UV-vis qui ont été obtenus de l’échantillon inconnu du PNN sont présentés à la figure 3 et leurs évaluations respectives sont résumées dans le tableau 6. L’écart type relatif des temps de rétention respectifs était considérablement faible et se situe entre 0,1 % et 0,5 %. En utilisant la fonction d’étalonnage de la taille des particules obtenue à partir de la fractionnement des normes de taille AuNP et en la corrélant avec les temps de rétention obtenus de l’échantillon inconnu d’AuNP au maximum de pointe UV-vis, un rayon hydrodynamique moyen global de 29,4 nm ± 0,2 nm a pu être calculé. En outre, une récupération de masse raisonnable de 83,1 % ± 1,2 % n’a été obtenue, ce qui indique qu’il n’y a pas eu d’agglomération ou de dissolution significative de l’échantillon auNP ni d’adsorption considérable de particules à la surface de la membrane. La figure 4 affiche la distribution obtenue de la taille des particules avec les neuf traces de signaux UV par rapport à la moyenne, ce qui met en évidence l’excellente robustesse de la méthode AF4 appliquée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Figure 1: Fractogrammes AF4-UV-vis obtenus à partir de l’analyse triplicate des quatre normes individuelles d’étalonnage de taille AuNP avec intensités de signal normalisées et taux de flux croisé constant appliqué (ligne noire). Le pic vide est mis en surbrillance en gris à environ 5,9 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Figure 2: Obtenu la fonction d’étalonnage de taille externe, y compris les barres d’erreur dérivées des écarts types respectifs des mesures DLS (tableau 4) et les écarts dans les temps de rétention AF4 obtenus (tableau 5), après avoir tracé le rayon hydrodynamique spécifié par rapport au temps de rétention de chaque norme d’étalonnage de taille AuNP à son maximum de pointe respectif. Une fonction d’étalonnage linéaire avec des erreurs standard sous forme de y = un + bx avec un = -3.373 nm ± 1.716 nm et b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 a été calculée à partir d’une analyse linéaire de régression. Un coefficient de corrélation au carré avec R2 = 0,9958 a été déterminé, ce qui indique une relation linéaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Figure 3: AF4-UV-vis fractograms des mesures de triplicate de trois aliquots affichant l’AuNP inconnu. Le débit croisé constant appliqué au cours du temps de mesure est illustré comme une ligne noire. Le pic de vide à environ 5,9 min est mis en évidence en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Figure 4: Superposition de la distribution moyenne obtenue de la taille des particules (rouge) de l’échantillon inconnu d’AuNP et de la fonction d’étalonnage linéaire appliquée (ligne pointillée). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>CAS-Non</td>
			<td>Poids (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Eau</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Octadecenoic acid (Z)-, composé avec 2,2',2''-nitrilotris[éthanol](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Carbonate de sodium</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alcools, C12-14-secondaire, éthoxylatés</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tetrasodium EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polyéthylène glycol</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oléate de sodium</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bicarbonate de sodium</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Liste des composants du mélange surfactant utilisé pour préparer l’élitiste (voir aussi Tableau des matériaux).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paramètres AF4-UV-vis</td>
			<td>Unité</td>
			<td>Valeur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Épaisseur de l’espaceur</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit du détecteur</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit croisé</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (constant pendant 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taux de flux de mise au point</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Délai / temps de stabilisation</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit d’injection</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps de transition</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d’injection</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape d’elution</td>
			<td>Min</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d’étape de rinçage</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit d’étape de rinçage</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume d’injection</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentration de l’échantillon</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de membrane</td>
			<td></td>
			<td>Cellulose régénérée</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coupure de poids moléculaire membranaire</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Éluant</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) mélange surfactant</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur d’onde UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilité UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2: Résumé des paramètres de la méthode de fractionnement AF4-UV-vis pour effectuer le run d’injection directe sans application d’une force de séparation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paramètres AF4-UV-vis</td>
			<td>Unité</td>
			<td>Valeur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Épaisseur de l’espaceur</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit du détecteur</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit croisé</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 min constant, 10 min linéaire)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taux de flux de mise au point</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Délai / temps de stabilisation</td>
			<td>Min</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit d’injection</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps de transition</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d’injection</td>
			<td>Min</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape d’elution</td>
			<td>Min</td>
			<td>70 (60 min constant, 10 min linéaire)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape de rinçage</td>
			<td>Min</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit d’étape de rinçage</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume d’injection</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentration de l’échantillon</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de membrane</td>
			<td></td>
			<td>Cellulose régénérée</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coupure de poids moléculaire membranaire</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Éluant</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) mélange surfactant</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur d’onde UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilité UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Résumé des paramètres de la méthode de fractionnement AF4-UV-vis pour effectuer l’exécution de fractionnement avec l’application d’un flux croisé comme force de séparation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Norme d’étalonnage</td>
			<td>Agent de plafonnement</td>
			<td>Taille moyenne (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (taille moyenne TEM) (%)</td>
			<td>Potentiel Zeta (mV)</td>
			<td>SD (potentiel zeta) (mV)</td>
			<td>Rayon hydrodynamique (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (rayon hydrodynamique) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrate</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrate</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrate</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrate</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Résumé des paramètres physico-chimiques des normes d’étalonnage auNP appliquées, y compris l’agent de plafonnement, la taille moyenne TEM, le potentiel zeta déterminé dans la suspension indigène ainsi que le rayon hydrodynamique DLS, et l’indice de polydispersité (IED) déterminé dans l’élixent.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Norme d’étalonnage</td>
			<td>Courir</td>
			<td>Temps de rétention au maximum de pointe (min)</td>
			<td>Temps net de rétention au maximum de pointe (min)</td>
			<td>Temps moyen de rétention nette (min)</td>
			<td>SD (%) (temps net de rétention)</td>
			<td>SD (min) (temps net de rétention)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5 : Temps de rétention des normes d’étalonnage AuNP au maximum de pointe UV-Vis respectif dérivé des fractogrammes AF4-UV-vis respectifs en utilisant la méthode décrite dans le tableau 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Courir</td>
			<td>Temps de rétention maximum maximum (min)</td>
			<td>Temps moyen de rétention au maximum de pointe (min)</td>
			<td>Temps net de rétention au maximum de pointe (min)</td>
			<td>SD (%) temps de rétention</td>
			<td>Rayon hydrodynamique (nm)</td>
			<td>Récupération (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 6 : Résumé des temps de rétention au maximum de pointe UV-Vis respectif, du rayon hydrodynamique calculé à partir de l’étalonnage de la taille externe (figure 2) et du taux de récupération de l’échantillon inconnu d’AuNP obtenu à partir de l’analyse AF4-UV-vis.

Ce protocole décrit l’utilisation de la fractionnement asymétrique de champ de flux de flux couplée à la détection uv-vis pour la détermination de la taille d’un échantillon inconnu de nanoparticules d’or.

Fractionnement asymétrique de flux de champ-flux pour le dimensionnement des nanoparticules d’or dans la suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

L’utilisation du fractionnement asymétrique du champ d’écoulement en combinaison avec l’étalonnage de taille externe est un outil puissant pour déterminer avec précision la distribution granulométrique des nanoparticules d’or en suspension. AF4 couvre toute la gamme de tailles, de un à 1000 nanomètres. Il est indépendant de la composition de l’échantillon et peut être appliqué même à des échantillons peu dispersés et complexes.La beauté de l’AF4 réside dans son très large champ d’application, qui couvre non seulement les nanoparticules de différentes natures et tailles, mais aussi les protéines, les virus ou les macromolécules synthétiques ou naturelles. Commencez par vortex 50 milligrammes par litre d’un étalon de taille de nanoparticules d’or arbitraire pendant deux minutes avant de diluer l’étalon dans un rapport de un à quatre avec de l’eau ultrapure. Ensuite, tourbillonnez la solution diluée pendant deux minutes supplémentaires pour obtenir une suspension homogénéisée.Après avoir nettoyé le système, ouvrez la cartouche AF4 pour permettre le remplacement de la membrane AF4. Rincez la nouvelle membrane avec de l’UPW et remontez la cartouche. Reconnectez ensuite la cartouche au système AF4-UV-vis.Rincez le système AF4-UV-vis nettoyé avec un éluant filtré et dégazé pendant au moins 30 minutes en appliquant un débit de pointe d’un millilitre par minute, un débit de focalisation d’un millilitre par minute et un débit transversal de 1,5 millilitre par minute, pour équilibrer la membrane, stabiliser le système et vérifier les fuites potentielles. La pression du système doit atteindre un niveau constant entre quatre et 12 bars. Pour qualifier le système AF4-UV-vis en déterminant la récupération de masse et la variation du temps de rétention à l’aide d’une norme de taille arbitraire de nanoparticules d’or, effectuez un cycle d’injection directe sans l’application d’une force de séparation.Effectuez ensuite un cycle de fractionnement avec l’application d’une force de séparation. Pour préparer des étalons de taille de nanoparticules d’or pour l’étalonnage de taille externe, vortex tous les étalons de taille de nanoparticules d’or de 50 milligrammes par litre pendant deux minutes et diluer chaque échantillon respectif pour l’analyse dans de l’eau ultrapure dans un rapport de un à quatre. Lorsque les normes de taille ont été préparées, sous l’onglet Méthode FFF, réglez le débit du détecteur à 500 microlitres par minute, le débit d’injection à 500 microlitres par minute et le temps d’injection à 0,1 minute.Réglez une durée d’élution de huit minutes sans force de séparation définie et injectez 10 microlitres du premier étalon dans le système. Lorsque toutes les normes de taille ont été mesurées, injectez 50 microlitres de la première norme dans le système. Réglez le débit du détecteur à 500 microlitres par minute.Réglez le délai à deux minutes, le débit d’injection à 200 microlitres par minute pendant cinq minutes et le temps de transition à 0,2 minute. Le débit de mise au point sera calculé automatiquement. Réglez la durée d’élution sur 60 minutes et le débit transversal sur un millilitre par minute.Cette méthode AF4 utilise un débit transversal constant qui est suivi d’une décroissance linéaire sur 10 minutes jusqu’à zéro microlitre par minute. Réglez l’étape de rinçage de neuf minutes avec un débit de pointe de 500 microlitres par minute. Lorsque tous les étalons de taille des nanoparticules d’or ont été fractionnés, préparez l’échantillon de nanoparticules d’or inconnues et effectuez une mesure par injection directe et un fractionnement de l’échantillon de nanoparticules d’or inconnues, comme nous venons de le démontrer.Pour analyser les données, importez les fichiers de données dans le logiciel système. Affichez les mesures dans l’onglet Vue d’ensemble et sélectionnez le signal du détecteur UV-vis dans la liste des détecteurs. Définissez une région d’intérêt et une ligne de base pour chaque mesure, en ajustant le signal et la vue de base si nécessaire.Utilisez la boîte à outils de traitement du signal pour lisser les signaux bruyants et utilisez la fonction d’affectation des paramètres de traitement à d’autres exécutions pour permettre l’attribution des paramètres à d’autres mesures. Pour effectuer un calcul de récupération de masse, ouvrez les mesures d’injection directe et les données de fractionnement. Insérez un étalonnage d’injection directe et sélectionnez les mesures d’injection directe respectives dans la vue des paramètres d’étalonnage d’injection directe.Le volume d’injection et la concentration de l’échantillon seront utilisés pour corréler la surface du pic avec la quantité injectée. Ensuite, utilisez la fonction d’affectation aux préréglages de particules sélectionnées pour attribuer la fonction d’étalonnage obtenue aux mesures de fractionnement respectives. Ensuite, utilisez l’équation pour calculer la récupération de masse des nanoparticules d’or en comparant la zone sous les pics UV-vis respectifs des mesures de fractionnement et d’injection directe.Pour afficher les résultats, ouvrez le calcul des résultats quantitatifs. Une concentration massique basée sur la surface du pic sera présentée. La récupération de masse peut être obtenue en comparant cette valeur à la concentration injectée.Sous l’onglet Taille des particules de la fenêtre d’étalonnage de la taille des particules, cliquez sur chaque mesure appropriée dans le tableau de sélection des références pour l’étalonnage pour sélectionner tous les cycles d’étalonnage. Les mesures seront affichées dans un tableau au fur et à mesure de leur sélection. Entrez le rayon hydrodynamique pour toutes les mesures d’étalonnage.La fonction et l’équation seront affichées dans la fenêtre de la fonction d’étalonnage de la taille des particules. Pour affecter la fonction d’étalonnage aux mesures de l’échantillon de nanoparticules d’or inconnues, sélectionnez les fractionnements respectifs dans la liste de sélection pour l’affectation et ouvrez un calcul de distribution granulométrique pour afficher les résultats. La taille calculée sera affichée dans la fenêtre de distribution des tailles, étiquetée au maximum maximal.Et l’étalonnage de la taille des particules précédemment créé sera répertorié comme l’étalonnage pour les mesures d’échantillons de nanoparticules d’or inconnues. Pour faire la moyenne de toutes les mesures d’un échantillon, cochez la case Moyenne des signaux pour l’échantillon. Le résultat sera répertorié dans l’étiquette du maximum de pointe.Ici, une superposition représentative d’étalons de taille de nanoparticules d’or fractionnées par AF4 et détectées par spectroscopie UV-vis mesure de l’absorbance des particules à une longueur d’onde de 532 nanomètres est présentée. L’écart-type relatif de tous les temps de rétention de chaque nanoparticule à son pic de spectroscopie UV-vis respectif obtenu à partir de mesures en trois exemplaires était inférieur à 1,1 %Une analyse de régression linéaire de ces données a abouti à une fonction d’étalonnage linéaire avec un coefficient de corrélation au carré, R au carré, de 0,9958. Lorsque neuf fractogrammes de spectroscopie AF4-UV-vis ont ensuite été obtenus à partir d’échantillons de nanoparticules d’or inconnues, l’écart-type relatif des temps de rétention respectifs était significativement faible, variant entre 0,1 et 0,5 %En utilisant la fonction d’étalonnage de la taille des particules obtenue à partir du fractionnement des étalons de taille de nanoparticules d’or et en corrélant ces données avec les temps de rétention obtenus de l’échantillon de nanoparticules d’or inconnues au maximum maximal de la spectroscopie UV-vis, Un rayon hydrodynamique moyen global a pu être calculé.De plus, une récupération de masse raisonnable a pu être obtenue, indiquant qu’il n’y a pas d’agglomération ou de dissolution significative des échantillons de nanoparticules d’or ou d’adsorption considérable des particules sur la surface de la membrane. Lors de l’utilisation d’un étalonnage de taille externe et d’une analyse AF4, il est de la plus haute importance que la même méthode AF4 soit appliquée de manière cohérente à tous les étalons de taille et à l’échantillon lui-même. AF4 permet aux chercheurs de mieux comprendre les propriétés de leurs échantillons de nanoparticules.Il s’agit donc d’un outil de contrôle de la qualité important qui contribue en fin de compte à améliorer l’efficacité des produits nanotechnologiques.

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