Quantification des effets des antimicrobiens sur l’architecture des biofilms in vitro à l’aide du logiciel COMSTAT

L’intérêt de ce protocole est qu’il offre un cadre simple et reproductible pour quantifier les structures de biofilms in vitro dans diverses conditions antimicrobiennes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’éliminer les variations subjectives associées au fonctionnement manuel de COMSTAT, ce qui facilite en fin de compte la standardisation et la transparence des expériences entre les centres de recherche. Pour imager les cultures de Pseudomonas aeruginosa, placez la plaque sur la platine d’un microscope confocal, équipé des longueurs d’onde d’excitation laser et des jeux de filtres appropriés.

Et utilisez un objectif d’immersion dans l’eau de 20 à 25x pour capturer au moins six images z-stack superposées du substrat au sommet de chaque segment de biofilm par incréments de 0,3 micromètre. Enregistrez ensuite les images au format OME-TIFF pour l’analyse COMSTAT. Une fois toutes les images acquises, ouvrez le paquet COMSTAT2 dans ImageJ et créez un dossier source sur le bureau.

Ajoutez un seul OME-TIFF au dossier et ouvrez OME-TIFF à partir du dossier source. Supprimez toutes les couches vides ne contenant pas de biomasse. Sélectionnez Fichier, Importer et Séquence d’images pour importer le fichier dans ImageJ.

Localisez et mettez en surbrillance le dossier source sans l’ouvrir, puis cliquez sur Sélectionner. Une fenêtre d’options de séquence apparaîtra, cliquez sur OK. Sélectionnez Image, Transformer et Inverser Z pour inverser l’orientation du biofilm de sorte que le substrat se trouve en haut de la pile. Pour définir les propriétés de l’image, sélectionnez Image et propriétés, une fenêtre source apparaîtra.

Spécifiez l’unité de longueur en micron, définissez la profondeur du voxel sur 0,3, puis cliquez sur OK. Sélectionnez Image, Ajuster et Seuil. Pour ajuster le seuil de l’image dans la fenêtre de seuil, placez le curseur inférieur à l’extrême droite pour définir manuellement la valeur de seuil maximale et utilisez le curseur supérieur pour définir le seuil minimum. Ensuite, utilisez le curseur dans la fenêtre de l’image pour faire défiler chaque calque afin de vous assurer que le bruit de fond est suffisamment supprimé dans toute la pile, puis sélectionnez Définir pour corriger la valeur de seuil inférieure.

Dans la fenêtre Définir les niveaux de seuil, sélectionnez OK, puis définissez et fixez la valeur de seuil maximale de la même manière. Sélectionnez Appliquer, cliquez sur OK dans la fenêtre de conversion de la pile en binaire qui s’affiche, puis quittez la fenêtre de seuil. Sélectionnez Plugins, Bio-Formats et Bio-Formats Exporter pour enregistrer le fichier avec un nouveau nom de fichier dans le dossier source.

Une fenêtre de plusieurs fichiers Bio-Formats Exporter apparaîtra, sélectionnez OK. Une fenêtre d’options Bio-Formats Exporter apparaîtra, sélectionnez à nouveau OK. Pour exécuter COMSTAT, sélectionnez les plug-ins et COMSTAT2, une fenêtre à propos apparaîtra, sélectionnez OK.In la fenêtre Répertoires observés, sélectionnez Ajouter, localisez et mettez en surbrillance le dossier source, mettez en surbrillance et cliquez sur Choisir. Une fenêtre Images dans les répertoires s’affiche et répertorie les OME-TIFF à analyser.

Dans la fenêtre COMSTAT2.1, désélectionnez Seuillage automatique Méthode Otsu et Filtrage des volumes connectés pour vous assurer que le logiciel utilise des valeurs de seuil prédéfinies pour chaque OME-TIFF. Dans la fenêtre COMSTAT2.1, sélectionnez Biomasse, Distribution de l’épaisseur et Surface, puis cliquez sur Aller pour exécuter le programme. Les données de sortie seront affichées dans la fenêtre du journal.

Les mesures seront automatiquement enregistrées sous forme de fichiers TXT dans le dossier source. Dans cette analyse représentative, un isolat de Pseudomonas aeruginosa, cultivé à partir d’un patient atteint de mucoviscidose infecté, a été utilisé pour démontrer les forces de cette approche, quantifiant de manière inprécise les changements induits par les antimicrobiens dans l’architecture du biofilm in vitro. L’imagerie de cellules vivantes peut également visualiser les changements dans la structure du biofilm de Pseudomonas aeruginosa avant et après le traitement monoclonal et à la tobramycine spécifiques du biofilm.

L’analyse des données COMSTAT a révélé des différences significatives entre les structures de biofilm traitées par rapport aux cultures témoins. Dans les cultures traitées à la tobramycine, une nette réduction de l’épaisseur moyenne et de la biomasse a été observée. Cependant, en présence d’anticorps, le biofilm de P. aeruginosa était résistant à ces changements structurels induits par la tobramycine.

Lors de l’examen du rapport surface/volume biologique, une réduction significative a été observée de la présence d’anticorps dans les biofilms exposés et non exposés à la tobramycine, indiquant la formation d’agrégats dans les cultures traitées par anticorps. Cette procédure peut être effectuée pour évaluer quantitativement ou comparer les effets de différents antimicrobiens utilisés pour perturber les matrices de biofilm. En utilisant cette technique comme cadre général, les chercheurs peuvent explorer différentes façons d’affiner le protocole afin d’inclure de nouveaux modèles mathématiques et des plugins algorithmiques dans ImageJ afin de mieux représenter l’hétérogénéité du biofilm.