Name: Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Apprenez l'expression et la purification d'IgG recombinantes fusionnées à GFP dans Nicotiana benthamiana par chromatographie en colonne. Cette méthode permet de visualiser les protéines à chaque étape du processus.

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Nous remercions Maria Pia DiPalma d’avoir édité la vidéo. Nous remercions également le Bureau de la sensibilisation à l’éducation et des services aux étudiants de l’Université d’État de l’Arizona pour leur généreuse aide aux frais de publication. La recherche pour ce protocole a été soutenue par la School of Life Sciences de l’Université d’État de l’Arizona.

1. Cultiver les plantes de N. benthamiana 
<ol><li>Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser les granulés de tourbe préalablement bouillis, encore chauds (~40-45 °C), l’eau sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Une fois les granulés complètement extensés, placez 2-3 graines de benthamiana N. sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler.</li>
	<li>Verser environ 0,5 dans l’eau pour couvrir le fond du plateau. Étiquetez le plateau avec la date d’ensemencement. Continuer à arroser les semis tous les jours avec des quantités appropriées d’engrais. La concentration d’engrais (aliments végétaux tout usage solubles dans l’eau) est généralement de 2,5 à 2,8 g/L.</li>
	<li>Couvrir le plateau d’un dessus humidome lorsqu’il est placé dans la chambre de croissance. Gardez les granulés de tourbe épépinés dans la chambre de croissance à 23-25 °C, avec une photopériodes de 16 h et une humidité relative de 60 %.</li>
	<li>Après une semaine, retirer les plantes supplémentaires en laissant chaque granulé avec un seul semis.</li>
	<li>Lorsque les plantes ont entre 2 et 3 semaines, transférer chaque granule de tourbe dans un pot individuel contenant un sol anti-humidité. Cette démonstration a utilisé le sol de mise en pot miracle-gro de contrôle d’humidité.</li>
	<li>Arroser quotidiennement avec un engrais de 1 g/L. Ne laissez jamais le sol complètement sec. Les plantes sont prêtes pour l’infiltration quand elles sont 5-6 semaines.</li>
</ol>2. Préparation d’Agrobacterium tumefaciens pour infiltration 
REMARQUE : Les constructions de fusion GFP-IgG peuvent être obtenues comme décrit dans ce document31. Le gène asGFP a été obtenu et optimisé pour les plantes à partir de cetteétude 45. Les étapes suivantes doivent être effectuées à côté d’un brûleur Bunsen, et des techniques aseptiques de base doivent être appliquées pour éviter la contamination.
<ol><li>Streak A. tumefaciens EHA105 hébergeant le virus nain jaune haricot (BeYDV)19 vecteur d’expression végétale pour chaque construction (asGFP-IgG, GFP-IgG, chaîne légère) à partir d’un stock de glycérol sur l’agar LB (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g d’extrait de levure, 15 g/L d’agar, 50 μg/mL de kanamycine).</li>
	<li>Cultivez pendant une journée dans un incubateur permanent de 30 °C. Isoler une colonie unique pour vérification selon le protocole PCR standard de l’écran de la colonie.</li>
	<li>Utilisez la colonie vérifiée pour chaque construction. Remplir le tube conique de 10 mL de lb (tryptone de 10 g/L, 10 g/L de NaCl, 5 g d’extrait de levure, 50 μg/mL). Ensuite, ajouter 10 μL de 100 μg/mL de kanamycine. Ajouter 10 μL de 2,5 μg/mL de rifampicine pour prévenir la contamination par E. coli. Incuber à 30°C et 120-150 rpm pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, si la culture agrobactérienne est cultivée à600 OD = 0,6-0,9, elle peut être utilisée pour l’infiltration. S’il est envahi (OD600 > 1), 1-2 mL doit être transféré à LB frais avec des antibiotiques et cultivé à l’OD600 requis. Selon la concentration de la culture initiale, il peut potentiellement prendre deux jours pour atteindre600 OD = 0,6-0,9.</li>
	<li>Une fois à l’OD600approprié, placer les cultures dans une centrifugeuse, et pelleter les bactéries par centrifugation à 4500 x g pendant 20 min, température ambiante (RT).</li>
	<li>Supernatant décantant des deux échantillons, puis résuspendez chaque granulé dans le tampon d’infiltration de 1x (10 mM 2-(N-morpholino) acide éthanesulfonique, 10 mM de sulfate de magnésium, ajusté au pH 5,5 avec KOH) pour obtenir l’ODfinal 600 = 0,4. Cela devrait prendre environ 15-45 mL de tampon d’infiltration, selon la densité de culture initiale. Combinez des volumes égaux de chaque construction de fusion IgG avec la construction de la chaîne de lumière pour obtenir l’ODfinal 600 = 0,2 par construction dans chaque tube.</li>
</ol>3. Agroinfiltration de seringue sans aiguille
<ol><li>Prenez un trombone redressé et des plants de N. benthamiana vieux de 5 à 6 semaines dès l’étape 1. À l’aide du bord tranchant du trombone, faire une petite ponction dans la première couche épidermique de la feuille sur la surface adaxiale. Évitez de le percer jusqu’au bout. REMARQUE : Les feuilles inférieures sont plus faciles à in infiltration, tandis que les feuilles sur le dessus de la plante sont plus dures. En général, l’expression des protéines recombinantes est la plus élevée dans les feuilles situées au milieu d’une plante, et ces feuilles deviennent également moins nécrotiques.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 1 mL, sans aiguille attachée, avec la solution Agrobacterium préparée dès l’étape 2. Couvrez le trou fait dans l’étape précédente avec l’extrémité de la seringue et poussez lentement pour injecter les bactéries dans la feuille tout en appliquant la contre-pression douce de derrière la feuille. Regardez la feuille s’assombrir au fur et à mesure que la solution est injectée sans appliquer trop de pression sur la seringue.</li>
	<li>Essayez de vous infiltrer dans la majeure partie de la zone des feuilles à un maximum de 3 à 4 fois – des dommages excessifs aux feuilles peuvent nuire au rendement en protéines. La feuille de plante infiltrée apparaîtra la plupart du temps foncée de la vue du bas. REMARQUE : Cette solution bactérienne devrait suffire pour au moins 3 à 4 plantes par construction. Autoclave toute solution bactérienne restante avant de jeter.</li>
</ol>4. Cultivez et observez le N. benthamiana infiltré 
<ol><li>Placez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance et continuez à arroser quotidiennement.</li>
	<li>Observez les feuilles pour la chlorose et la nécrose dans les zones infiltrées. Observez les plantes pour la fluorescence GFP (si GFP est présent) sous une lampe UV à ondes longues et courtes.</li>
	<li>Le jour 4-5 montre la fluorescence la plus élevée des deux constructions GFP dans les feuilles. Récoltez toutes les feuilles à 4-5 dpi (jours après l’infiltration) et pesez la matière totale des feuilles.</li>
	<li>Utilisez-le immédiatement pour le traitement en aval ou conservez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</li>
</ol>5. Extraction de protéines
<ol><li>Gardez les tampons et les tasses de mélangeur sur la glace ou à 4 °C avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 2-3 mL de tampon d’extraction glacée (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 avec HCl) par 1 g de matériel végétal. Ajouter 2 mM de fluorure de phényléthylsulfonyl (PMSF) provenant du bouillon (100 mM) et 50 mM d’ascorbate de sodium au tampon d’extraction juste avant l’extraction.</li>
	<li>Placer le tissu végétaux de l’étape 4 dans la tasse du mélangeur préchaillé. Ajouter une quantité mesurée de tampon d’extraction réfrigérée à la tasse du mélangeur (comme indiqué à l’étape 5.2). Déposer la tasse du mélangeur sur le mélangeur. Prenez une feuille pré-coupée de parafilm et étirez-la sur le dessus de la tasse du mélangeur. Mélanger à l’homogénéité avec des intervalles de 20 secondes, en remuant bien entre les cycles de mélange au besoin.</li>
	<li>Transférer le matériel mélangé dans un bécher. Ajouter une barre de remue-remuer et remuer à 4 °C pendant 30 min pour améliorer la solubilité protéique et permettre la précipitation des solides.</li>
	<li>Placez 2 couches de Miracloth sur un bécher propre sur la glace et versez l’extrait à travers elle pour enlever les gros débris de feuilles. Après que tout l’extrait soit versé, pliez le Miracloth pour presser l’extrait résiduel de feuille. L’extrait doit apparaître vert foncé sans particules visibles.</li>
	<li>Transférer 50 μL de cet échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL et étiqueter « extrait total » pour analyse ultérieure. Transférer l’extrait dans des tubes de centrifugeuse. Centrifuger le reste de l’extrait végétal à 16 000 x g pendant 20 min, 4 °C et transférer le supernatant dans un tube conique.</li>
	<li>Filtrer l’extrait soluble à l’aide d’une seringue de 50 mL et d’un filtre à fibres de verre seringue (0,75 μm).</li>
	<li>Recueillir 50 μL d’un échantillon après centrifugation, étiqueter « extrait soluble » pour une analyse ultérieure.</li>
</ol>6. Procédure de chromatographie de colonne de protéine G
REMARQUE : Le protocole décrit ici est pour la chromatographie de gravity-flow utilisant la résine d’agarose de protéine de Pierce G. Si vous utilisez une résine différente, consultez les instructions du fabricant pour les ajustements. Ne laissez jamais la résine sécher et empêchez tout liquide de s’écouler. Récapitulez la prise au besoin.
<ol><li>Installez une colonne de polypropylène qui contient 20 mL d’échantillon.</li>
	<li>Estimer la quantité de boue nécessaire en fonction du type d’immunoglobuline cible et de son affinité avec la résine. En général, 3 mL de boue totale avec un volume de lit de 1,5 mL est suffisant pour la purification de plusieurs milligrammes d’Ab.</li>
	<li>Versez soigneusement la quantité requise de boue résuspendée dans la colonne plafonnée. Ouvrez la sortie de colonne à partir du bas de la colonne et laissez-la s’écouler jusqu’à ce que la majeure partie du tampon soit partie.</li>
	<li>Versez immédiatement 10 mL de tampon de lavage 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4 avec HCl) sur le dessus. Laissez-le s’écouler et répétez cette étape de lavage 2x.</li>
	<li>Appliquez l’échantillon filtré de l’étape 5 à la colonne et recueillez le flowthrough — aliquot 50 μL de flowthrough pour une analyse ultérieure. Enregistrez le reste du flux au cas où l’Ab ne se lierait pas à la résine. REMARQUE : Le ré-application de la procédure d’écoulement à une nouvelle colonne n’entraîne généralement pas un bon rendement; il est donc conseillé de commencer par de nouveaux matériaux folio.</li>
	<li>Lavez la résine deux fois avec 10 mL de 1x PBS pour réduire la liaison non spécifique. Si désiré, aliquot 50 μL de lavage que le tampon s’écoule à travers la colonne pour vérifier que la cible Ab n’est pas élucidé avec un tampon de lavage.</li>
	<li>Installez et étiquetez cinq tubes avec 125 μL de Tris-HCl stérile de 1 M au pH 8. Il s’agit de neutraliser les abdos dans le tampon d’élitution acide pour éviter les changements structurels potentiels. Sinon, ajoutez 30 μL de base tris de 2 M pour obtenir un échantillon moins dilué. ATTENTION : Pendant l’éution, la lumière UV peut être utilisée pour la visualisation. Cela n’a pas besoin d’être fait pour la durée de l’élitution. Si les UV sont utilisés, assurez-vous de porter des EPI appropriés pour éviter les dommages aux yeux et à la peau. Une lumière UV n’a pas besoin d’être utilisée pendant l’étape d’élitution.</li>
	<li>Elute les Abdos en appliquant 5 mL de tampon d’élitution (100 mM de glycine, pH 2,5 avec HCl) à la colonne et de recueillir 1 fractions mL à chaque tube désigné de l’étape précédente.</li>
	<li>Régénérez immédiatement la colonne en appliquant 20 mL de tampon de lavage, suivi de 10 mL de tampon de lavage. Assurez-vous que la résine n’est pas laissée dans un environnement acide pendant une longue période. Les élitutions doivent apparaître fluorescentes, souvent la fluorescence la plus élevée est observée dans la deuxième élitution, mais peut varier d’une extraction à l’autre.</li>
	<li>Pour le stockage, laver la résine avec 10 mL de 20% d’éthanol dans PBS et laisser égoutter à mi-chemin. Récapitulez le haut, puis le bas de la colonne, et maintenez la verticale à 4 °C. REMARQUE : En général, les résines de protéine G peuvent être réutilisées jusqu’à 10 fois sans perte significative d’efficacité. Consultez les lignes directrices du fabricant pour plus de détails.</li>
	<li>Déterminer la concentration d’Ab à l’aide d’un spectrophotomètre en mesurant l’absorption à 280 nm, en utilisant le tampon d’élitution comme blanc. Conservez les évasés en -80 °C et aliquot 50 μL de chaque fraction dans un tube séparé pour une analyse plus approfondie.</li>
</ol>7. SDS-PAGE pour la détection de fusion GFP-Ig
<ol><li>Préparez tous les échantillons avant de mettre en place le SDS-PAGE.<ol>
<li>Ajouter 4 μL de tampon d’échantillon (tampon d’échantillon réducteur de 6 x : 3,0 mL de glycérol, 0,93 g de TNT, 1 g de SDS, 7 mL de Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de bleu bromophénol); (tampon d’échantillon non réducteur 6x : 3,0 mL de glycérol, 1 g de SDS, 7 mL de Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de bromophénol bleu) à 20 μL de chaque échantillon (extrait total, extrait soluble, écoulement, lavage, toutes les fractions d’elution) pour analyse. Assurez-vous que les bouchons de tube sont solidement fixés.</li>
		<li>Traiter seulement les échantillons de réduction pendant 5 min dans un bain d’eau bouillante, puis mettre des échantillons pendant 5 min sur la glace. Faites tourner des échantillons dans une microcentrifugeuse pendant ~5 s et chargez 20 μL de chaque échantillon dans l’ordre de collecte dans les puits de gel. Chargez 3 μL d’échelle protéique bicolore dans un puits séparé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez le gel SDS-PAGE à une séparation constante de 100 V à la bande protéique désirée; cela prend environ 1,5 heure. Surveillez l’échelle comme indicateur de séparation des protéines.</li>
	<li>Visualisez le gel sous les UV pour observer la fluorescence GFP.</li>
	<li>Si désiré, tacher le gel avec la tache coomassie pour évaluer la protéine totale dans chaque échantillon. Alternativement, effectuez la tache occidentale pour évaluer la protéine cible utilisant des abs spécifiques. REMARQUE : La coloration de Coomassie et la tache occidentale peuvent être exécutées en suivant les protocoles standard47,48.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole peut être utilisé pour la vérification visuelle de tout Ab recombinant ou protéine recombinante produite dans les plantes de N. benthamiana, y compris celles qui nécessitent une exposition temporaire à des environnements acides à des fins de purification descolonnes 42,43,44. En outre, la fusion de l’asGFP à d’autres protéines dans différents systèmes d’expression peut être un outil utile pour la visualisat...

Les rapports de l’industrie indiquent que treize des vingt médicaments les plus riches aux États-Unis étaient des produits biologiques (produits pharmaceutiques à base de protéines), dont neuf étaient des anticorps. En 2019, il y avait plus de 570 anticorps (Ab) thérapeutiques à différentes phasesde développement clinique 1,2,3. Les ventes mondiales actuelles d’Ab dépassent les 100 milliards USD, et le marché thérapeutique monoclonal ab (mAb) devrait générer jusqu’à 300 milliards usd d’ici 20251,4. Avec une demande aussi forte et des augmentations prévues des revenus, les chercheurs ont travaillé à développer des moyens de produire des produits thérapeutiques Ab à une échelle toujours plus grande, avec une meilleure qualité et des coûts inférieurs. Les systèmes d’expression à base de plantes ont plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires mammifères traditionnelles pour la fabrication abordable et à grande échelle d’Ab therapeutics5,6. La production de protéines thérapeutiques dans les plantes (« pharming moléculaire ») ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux ou d’installations de culture cellulaire, tout comme les techniques traditionnelles de culture cellulairedes mammifères 7,8. Les plantes ne peuvent pas contracter d’agents pathogènes humains, ce qui minimise la contaminationpotentielle 9. L’expression transitoire et transgénique des protéines végétales peut être utilisée comme alternative à moindre coût aux systèmes de production de mammifères ou de bactéries10. Bien que les plantes transgéniques soient préférées pour la production agricole, la production de protéines recombinantes à l’aide de cette méthode peut nécessiter des semaines à des mois. Les progrès de l’expression transitoire à l’aide de vecteurs viraux par l’agroinfiltration seringue ou vide permettent la production à petite et à grande échelle, respectivement, de la protéine désirée dansles jours 11,12,13,14. La production de mAbs contre Ebola, dengue et Zika, et de nombreuses autres protéines recombinantes, ont été produites et purifiées rapidement et efficacement en utilisant l’expression transitoire dans les plantes de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Ces circonstances font de l’expression végétale transitoire une option attrayante pour développer plusieurs ab thérapeutiques et les méthodes démontrées dans ce protocole20.
Les mAbs de première génération étaient de dérivation murine, qui a eu comme conséquence l’immunogénicité non spécifique une fois employée dans les essais humains21. Au fil du temps, chimérique, humanisé, et finalement, abs entièrement humains ont été produites pour diminuer l’immunogénicité induite par ab thérapeutique. Malheureusement, certains de ces abs causent encore l’immunogénicité d’hôte due aux différences dans la glycosylation21. Les développements dans l’ingénierie végétale ont permis la modification d’Ab glycans, qui est essentielle puisque la stabilité et la fonction d’un Ab peuvent être sensiblement affectées par son état de glycosylation22. Les progrès ont permis la production dans les systèmes végétaux d’expression de haut niveau de mAbs humanisés, contenant des glycanes humains et, par conséquent, les traits biologiques désirés d’un produit pharmaceutique humainproduit en série 19,21.
En plus des abs recombinants, les molécules de fusion Ab (Fusions Ab) ont été explorées à diverses fins au cours des dernières décennies. Ab fusions se composent souvent d’un ab ou ab fragment fusionné à une molécule ou une protéine et sont conçus pour obtenir des réponses des cellules effectrices immunitaires23. Ces molécules ont été créées comme interventions thérapeutiques potentielles pour traiter diverses pathologies telles que le cancer et les maladies auto-immunes24,25,26,27. Les complexes immunitaires recombinants (CCI) sont une autre classe de fusions Ab qui ont été utilisées comme candidats vaccins28. Les CCI profitent de la capacité du système immunitaire à reconnaître les régions fc des fusions Ab et ont été trouvés pour améliorer l’immunogénicité lorsqu’ils sont combinés avec d’autresplates-formes vaccinales 29,30,31.
La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine bioluminescente dérivée de la méduse Aequorea Victoria, qui émet de la lumière verte lorsqu’elle est excitée par la lumièreultraviolette 32,33. Au fil des ans, l’utilisation de GFP comme marqueur visuel de l’expression des gènes est passé de l’expression chez Escherichia coli à de nombreux systèmes d’expression protéique, y compris les plantes N. benthamiana 34,35,36,37,38. Les marqueurs visibles, tels que le GFP, ont des implications abondantes dans l’enseignement et l’apprentissage des concepts scientifiques. De nombreux étudiants d’entrée de gamme décrivent des difficultés à saisir des concepts scientifiques lorsque l’idée enseignée n’est pas visible à l’œil nu, comme les concepts de biologie moléculaire et les domainesconnexes 39. Les marqueurs visuels, comme le GFP, peuvent ainsi contribuer au traitement de l’information liée aux processus scientifiques et pourraient aider à atténuer les difficultés que les élèves signalent dans l’apprentissage de nombreux concepts scientifiques.
Bien que le GFP soit souvent utilisé comme marqueur pour indiquer le gène et l’expression in vivo,il est difficile de le visualiser dans les processus en aval si l’on utilise des conditions acides. Cette circonstance est principalement parce que GFP ne maintient pas sa structure et la fluorescence qui en résulte à un faible pH40. Des environnements acides temporaires sont souvent nécessaires dans divers processus de purification, tels que la protéine G, la protéine A et la chromatographie L protéique, souvent utilisée pour la purification ab41,42,43,44. Mutants GFP ont été utilisés pour retenir la fluorescence dans des conditions acides45,46.
Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification des protéines de fusion IgG recombinantes dans les plantes de N. benthamiana. Nous avons produit le GFP traditionnel fusionné au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion GFP-IgG. Simultanément, nous avons développé la fusion d’une séquence optimisée par codon végétal pour un GFP acidulé (asGFP) au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion asGFP-IgG. Les avantages de la production de GFP-IgG comprennent la capacité de visualiser la présence d’une protéine cible pendant l’expression, tandis que asGFP-IgG permet de voir la présence de protéines recombinantes non seulement dans les étapes d’expression et d’extraction, mais aussi dans les étapes de purification de la protéine. Ce protocole peut être adapté pour la production, la purification et la visualisation d’une gamme de protéines de fusion GFP produites en N. benthamiana et purifiées à l’aide de techniques de chromatographie qui nécessitent un faible pH. Le processus peut également être adapté à diverses quantités de matériaux foliiques. Bien que les abs et les protéines de fusion étiquetées avec GFP ou asGFP ne soient pas destinés à être utilisés pour des thérapies, ces méthodes peuvent être utiles comme témoins pendant les expériences et peuvent également être utilisées comme un outil d’enseignement pour la biologie moléculaire et cellulaire et la biotechnologie, en personne et virtuellement.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 5 mL</td><td>n’importe quelle</td><td>seringue de 50</td><td></td></tr><tr><td>mL</td><td>n’importe quelle</td><td>gélose N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur avec gobelets</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ( Acide éthylènedinitrilo)tétraacétique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Acide chlorhydrique)</td><td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>tout fournisseur réputé</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jiffy-7 727 avec trous de granulés de tourbe</td><td>Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (chlorure de potassium)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (phosphate de potassium)</td><td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (hydroxyde de potassium)</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (acide 2-(N-Morpholino)éthanesulfonique)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de contrôle de l’humidité</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (Phosphate de sodium)</td><td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (chlorure de sodium)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana graines</td><td>tout fournisseur réputé</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Fluorure de phénylméthylsulfonyle)</td><td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de polypropylène</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>Résine de protéine G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td><td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>tout fournisseur réputé</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Titan3 0,75 et micro ; m filtre en fibre de verre</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>Plateau pour granulés de tourbe avec dôme</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Base</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Soluble dans l’eau Tout usage Engrais pour plantes</td><td>Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td>Extrait</td><td>de levure SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

production de protéines de fusion igg exprimées transitoirement à nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

La forte demande d’anticorps en tant qu’interventions thérapeutiques pour diverses maladies infectieuses, métaboliques, auto-immunes, néoplastiques et autres crée un besoin croissant de développer des méthodes efficaces pour la production d’anticorps recombinants. En 2019, il y avait plus de 70 anticorps monoclonaux approuvés par la FDA, et il y a un potentiel de croissance exponentiel. Malgré leur promesse, les coûts de fabrication et la complexité sont des facteurs limitants pour une utilisation généralisée. Potentiellement, les usines offrent des stratégies de fabrication de protéines peu rentables, sûres et facilement évolutives. Des plantes comme Nicotiana benthamiana peuvent non seulement plier et assembler correctement des protéines mammifères complexes, mais aussi ajouter des modifications post-translationnelles critiques semblables à celles offertes par les cultures cellulaires mammifères. Dans ce travail, en utilisant le GFP indigène et une variante acide-stable de protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée aux anticorps monoclonaux humains, nous avons pu visualiser l’ensemble du processus transitoire d’expression et de purification d’anticorps des usines de N. benthamiana. Selon le but de l’expérience, la fusion GFP native peut assurer une visualisation plus facile pendant la phase d’expression dans les plantes, tandis que la fusion GFP acidulée permet une visualisation pendant le traitement en aval. Cette procédure évolutive et simple peut être effectuée par un seul chercheur pour produire des quantités milligrammes de protéines de fusion d’anticorps ou d’anticorps très pures en quelques jours en utilisant seulement quelques petites plantes. Une telle technique peut être étendue à la visualisation de tout type de processus de purification des anticorps et potentiellement de nombreuses autres protéines, à la fois dans les systèmes végétaux et d’autres systèmes d’expression. En outre, ces techniques peuvent bénéficier d’instructions virtuelles et être exécutées dans un laboratoire d’enseignement par des étudiants de premier cycle possédant une expérience minimale préalable avec les techniques de biologie moléculaire, fournissant une base pour l’exploration basée sur des projets avec des applications réelles.

Cette étude démontre une méthode facile et rapide pour produire des protéines recombinantes et les visualiser tout au long des processus en aval. En utilisant N. benthamiana et en suivant le protocole fourni, la production de protéines recombinantes décrite ici peut être réalisée en moins d’une semaine. Le flux de travail global de l’expression, de l’extraction et de la purification des plantes est indiqué à la figure 1. Les stades de croissance des plantes à partir de semis de 2 se...

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction, et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans Nicotiana benthamiana. Ce protocole peut être étendu à la purification et à la visualisation de nombreuses protéines qui utilisent la chromatographie des colonnes. De plus, le protocole s’adapte au laboratoire d’enseignement collégial virtuel et en personne, offrant une exploration axée sur des projets.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Il s’agit d’une démonstration d’une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans les plantes nicotiana benthamiana liées au tabac. Ce protocole peut être utilisé pour la purification et la visualisation des anticorps produits par les plantes, des fusions d’anticorps et de la plupart des protéines qui peuvent être purifiées par chromatographie des colonnes. Ce protocole permet aux chercheurs et aux étudiants des laboratoires de travail universitaires de visualiser les protéines étiquetées GFP à la plupart des étapes du processus de production de protéines.Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser de l’eau préalablement bouillie et encore chaude sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Les granulés ront quelques minutes pour se développer complètement. Une fois les palettes complètement élargies, placez deux à trois graines de nicotiana benthamiana sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler.Une fois cela fait, vous aurez besoin de verser environ 0,5 pouces d’eau pour couvrir le fond du plateau. N’oubliez pas d’étiqueter le plateau avec la date d’ensemencement. Con

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Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible...

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l'infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l'accumulation de cible en optimisant les conditions de culture de bactéries, la sélection des espèces hôtes, et co-introduction de RNA...

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

Dans cette étude, l’expression d’une protéine recombinante humaine cible dans différentes plateformes de production a été comparée. Nous nous sommes concentrés sur les cultures traditionnelles à base de fermenteurs et sur les plantes, en décrivant la configuration de chaque système et en mettant en évidence, sur la base des résultats rapportés, les limites et les avantages inhérents à chaque plateforme.

Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et Plant Systems

Les systèmes d'expression de cellules d'insecte non lytique sont sous-utilisées pour la production, le trafic / la localisation cellulaire, la protéine recombinante et l'analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici les méthodes pour générer des vecteurs d'expression et l'expression des protéines transitoire suivante dans des lignées cellulaires lépidoptères disponibles dans le commerce. La co-localisation de Bemisia tabaci aquaporines avec des protéines de marqueur fluorescent subcellulaires est...

Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d&#39;insectes Cultured

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans les feuilles de Nicotiana benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène. Ici est décrit un protocole détaillé pour la production à l’échelle préparative rapide (5 jours) de triterpènes et analogues utilisant cette plate-forme puissante à base de plantes.

Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Apprenez l'expression et la purification d'IgG recombinantes fusionnées à GFP dans Nicotiana benthamiana par chromatographie en colonne. Cette méthode permet de visualiser les protéines à chaque étape du processus.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

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