Name: Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez à isoler des cellules souches du cancer du sein humain à partir d'échantillons cellulaires et tissulaires. Cette méthode permet d'évaluer leur fonction in vitro et in vivo pour développer des stratégies thérapeutiques ciblées.

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Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs discussions utiles et leur soutien. Notre recherche sur les cellules souches du cancer du sein et le microenvironnement tumoral est financée par des subventions de l’Institut de recherche de la Société canadienne de recherche sur le cancer et du U.S. Army Department of Defense Breast Cancer Program (subvention # BC160912). V.B. est soutenu par une bourse postdoctorale Western (Université Western), et A.L.A. et V.B. sont soutenus par la Société du cancer du sein du Canada. C.L. est soutenu par une bourse d’études supérieures du Canada Vanier du gouvernement du Canada.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les métastases du cancer du sein et la résistance au traitement sont devenues des causes majeures de mortalité chez les femmes dans le monde entier. L’existence d’une sous-population de cellules souches du cancer du sein (CSBC) contribue à l’augmentation des métastases 26,43,44,45,46 et à la résistance au traitement21,47,48.<...

Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des cellules souches du cancer du sein humain (CSCA) est crucial pour relever les défis rencontrés dans le traitement du cancer du sein. L’émergence du concept BCSC remonte au début du 21esiècle, où une petite population de cellules cancéreuses du sein CD44 + CD24 / faible s’est avérée capable de générer des tumeurs hétérogènes chez la souris 1,2. Par la suite, il a été observé que les cellules cancéreuses du sein humain ayant une activité enzymatique élevée de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDHélevée) présentaient également des propriétés similaires à celles des cellules souches3. Ces BCSC représentent une petite population de cellules capables de s’auto-renouveler et de se différencier, contribuant à la nature hétérogène des tumeurs en vrac 1,2,3. L’accumulation de preuves suggère que les altérations des voies de signalisation conservées au cours de l’évolution déterminent la survie et le maintiende la BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . En outre, il a été démontré que le microenvironnement extrinsèque cellulaire joue un rôle central dans la dictée des différentes fonctions BCSC15,16,17. Ces voies moléculaires et les facteurs externes régulant la fonction BCSC contribuent à la rechute du cancer du sein, aux métastases18 et au développement d’une résistance aux thérapies 19,20,21, l’existence résiduelle de BCSC post-traitement posant un défi majeur pour la survie globale des patientes atteintes d’un cancer du sein22,23 . L’évaluation préclinique de ces facteurs est donc très importante pour identifier les thérapies ciblant le BCSC qui pourraient être bénéfiques pour obtenir de meilleurs résultats de traitement et améliorer la survie globale chez les patientes atteintes d’un cancer du sein.
Plusieurs modèles in vitro de lignées cellulaires de cancer du sein humain et modèles in vivo de xénogreffes humaines ont été utilisés pour caractériser les CSCA 24,25,26,27,28,29. La capacité des lignées cellulaires à se repeupler continuellement après chaque passage successif en fait un système modèle idéal pour effectuer des études omiques et pharmacogénomiques. Cependant, les lignées cellulaires ne parviennent souvent pas à récapituler l’hétérogénéité observée dans les échantillons de patients. Par conséquent, il est important de compléter les données de lignées cellulaires avec des échantillons dérivés de patients. L’isolement des CSCA dans leur forme la plus pure est important pour permettre une caractérisation détaillée des CSCA. L’atteinte de cette pureté dépend de la sélection de marqueurs phénotypiques spécifiques aux CSBC. Actuellement, le phénotypeALDH à CD44+CD24- élevé est le plus souvent utilisé pour distinguer et isoler les BCSC humaines des populations de cellules cancéreuses du sein en vrac en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour une pureté maximale1, 3,26. De plus, les propriétés des BCSC isolées, telles que l’auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation, peuvent être évaluées à l’aide de techniques in vitro et in vivo.
Par exemple, les essais in vitro formant des colonies peuvent être utilisés pour évaluer la capacité d’une seule cellule à s’auto-renouveler pour former une colonie de 50 cellules ou plus en présence de différentes conditions de traitement30. Les tests de mammosphère peuvent également être utilisés pour évaluer le potentiel d’auto-renouvellement des cellules cancéreuses du sein dans des conditions indépendantes de l’ancrage. Ce test mesure la capacité de cellules individuelles à générer et à se développer sous forme de sphères (mélange de BCSC et de non-BCSC) à chaque passage successif dans des conditions de culture non adhérentes sans sérum31. De plus, des modèles de culture en 3 dimensions (3D) peuvent être utilisés pour évaluer la fonction BCSC, y compris les interactions cellule-cellule et cellule-matrice qui récapitulent étroitement le microenvironnement in vivo et permettent d’étudier l’activité des thérapies potentielles ciblant le BCSC32. Malgré les diverses applications des modèles in vitro, il est difficile de modéliser la complexité des conditions in vivo en utilisant uniquement des essais in vitro. Ce défi peut être surmonté en utilisant des modèles de xénogreffes de souris pour évaluer le comportement de BCSC in vivo. En particulier, ces modèles constituent un système idéal pour évaluer les métastases du cancer du sein33, étudier les interactions avec le microenvironnement au cours de la progression de la maladie 34, l’imagerie in vivo 35 et prédire la toxicité et l’efficacité spécifiques au patient des agents antitumoraux 34.
Ce protocole fournit une description détaillée de l’isolement des BCSC humains à CD44+CD24- élevés en ALDHà unepureté maximale à partir de populations en vrac de cellules hétérogènes du cancer du sein. Nous fournissons également une description détaillée de trois techniques in vitro (test de formation de colonies, test de mammosphère et modèle de culture 3D) et un test de xénogreffe tumorale in vivo qui peut être utilisé pour évaluer différentes fonctions des BCSC. Ces méthodes seraient appropriées pour les chercheurs intéressés à isoler et à caractériser les CSCA à partir de lignées cellulaires de cancer du sein humain ou de cellules cancéreuses du sein et de tissus tumoraux dérivés de patients primaires dans le but de comprendre la biologie du BCSC et/ou d’étudier de nouvelles thérapies ciblant le BCSC.

<table><tbody><tr><td>7-Aminoactinomycine D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>suggéré : 0,25 & micro ; g/1x106 cellules</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Substrat d’aldéhyde déshydrogénase (ALDH)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Vendu dans le commerce dans le cadre du kit de dosage ALDEFLOUR ; suivez les instructions du fabricant pour la préparation du substrat ALDH</td></tr><tr><td>Extrait de membrane basale (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Vendu sous le nom commercial Matrigel</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire : 6 puits</td><td></td><td>Corning 877218</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire : 60 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire : 96 puits à très faible fixation</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire : 40 microns</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>Préparer une dilution 1:30 de 3 mg/mL de collagène dans du PBS</td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>Tubes coniques : 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>Violet cristallin</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>Utiliser une solution de violet cristallin à 0,05 % dans l’eau pour la coloration</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM :F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Avec L-glutamine et 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0,1 mg/mL concentration finale</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&nbsp ; Tubes </td></tr><tr><td>Flow : 5ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>Tubes à fond rond en polypropylène</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD24 de souris</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-phycoérythrine et colorant cyanine conjugué Clone :</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD44 de souris</td> ML5 <td>BD</td><td>555479</td><td>R-phycoérythrine conjuguée, Clone : G44-26</td></tr><tr><td>N, N-diétéhylaminobenzaldéhyde (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Vendu commercialement dans le cadre du kit de dosage ALDEFLOUR ; suivre les instructions du fabricant Préparation du DEAB</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, Sans calcium ni magnésium</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mammosphere Media Composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04 %</td></tr><tr><td>DMEM :F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Avec L-glutamine et 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D Organoid Support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM :F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Avec L-glutamine et 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Neuréguline &bêta ; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R& D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro ; L</td></tr></tbody></table>

isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Les cellules souches du cancer du sein (CSBC) sont des cellules cancéreuses dont les caractéristiques héréditaires ou acquises ressemblent à des cellules souches. Malgré leur faible fréquence, elles contribuent grandement à l’initiation du cancer du sein, aux rechutes, aux métastases et à la résistance au traitement. Il est impératif de comprendre la biologie des cellules souches du cancer du sein afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter le cancer du sein. Les cellules souches du cancer du sein sont isolées et caractérisées en fonction de l’expression de marqueurs de surface cellulaire uniques tels que CD44, CD24 et l’activité enzymatique de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH). Ces cellules ALDHà CD44+CD24- élevé constituent la population BCSC et peuvent être isolées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour des études fonctionnelles en aval. Selon la question scientifique, différentes méthodes in vitro et in vivo peuvent être utilisées pour évaluer les caractéristiques fonctionnelles des BCSC. Ici, nous fournissons un protocole expérimental détaillé pour l’isolement des BCSC humains à partir de populations hétérogènes de cellules cancéreuses du sein ainsi que de tissus tumoraux primaires obtenus à partir de patientes atteintes d’un cancer du sein. En outre, nous mettons en évidence des tests fonctionnels in vitro et in vivo en aval, y compris des tests de formation de colonies, des tests de mammosphère, des modèles de culture 3D et des tests de xénogreffe tumorale qui peuvent être utilisés pour évaluer la fonction BCSC.

Le protocole décrit permet d’isoler des CSCA humaines à partir d’une population hétérogène de cellules cancéreuses du sein, soit à partir de lignées cellulaires, soit à partir de tissus tumoraux dissociés. Pour une lignée cellulaire ou un échantillon de tissu donné, il est crucial de générer une suspension unicellulaire uniforme pour isoler les CSCA avec une pureté maximale, car la contamination des populations non BCSC pourrait entraîner des réponses cellulaires variables, en particulier si le but de l’étude est d’évalu...

Ce protocole expérimental décrit l’isolement des CSCA à partir d’échantillons de cellules et de tissus cancéreux du sein ainsi que les tests in vitro et in vivo qui peuvent être utilisés pour évaluer le phénotype et la fonction des CSBC.

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Cette technique permettra aux chercheurs d’isoler les cellules souches du cancer du sein avec une pureté et une viabilité maximales pour la réalisation d’essais de caractérisation fonctionnelle in vitro et in vivo. Les cellules souches isolées du cancer du sein peuvent également être utilisées pour aider à élucider les événements moléculaires qui contrôlent la tumorigénicité et les métastases, et pour concevoir des stratégies thérapeutiques visant à cibler ces cellules. Avec des modifications mineures spécifiques aux types de cellules et de tissus d’intérêt, cette méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes.Pour générer une suspension unicellulaire à partir d’une culture cellulaire, lavez une culture cellulaire de cancer du sein confluente à 80 % avec du PBS et traitez les cellules avec une solution de dissociation cellulaire appropriée pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture pour neutraliser la solution de dissociation cellulaire et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de PBS pour le comptage.Après le comptage, centrifugez à nouveau les cellules, puis remettez-les en suspension à une fois 10 à six cellules par millilitre de tampon de substrat ALDH. Pour générer une suspension cellulaire unique à partir d’un échantillon de tissu, utilisez des lames chirurgicales dans une technique d’entrecroisement pour hacher le tissu tumoral en morceaux d’environ un millimètre. Placez les morceaux dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de tampon de dissociation.Scellez le tube avec du parafilm pour une incubation de 40 minutes à 37 degrés Celsius dans un agitateur et sédimentez les morceaux de tissu digérés par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de trypsine à l’aide d’une pipette de cinq millilitres et incubez le tissu dans un bain-marie à 37 degrés pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, pipetez vigoureusement le tissu plusieurs fois pour libérer les cellules individuelles et ajoutez suffisamment de milieu DMEM/F-12 pour porter le volume total du tube à 25 millilitres.Collectez les cellules par centrifugation, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de Displace DNAse et incubez pendant cinq minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, porter le volume total à 10 millilitres avec du PBS. Mélangez les cellules par pipetage et passez-les à travers une passoire de cellules de 40 microns dans un tube de 50 millilitres.Après la centrifugation, remettre les cellules en suspension dans cinq millilitres de PBS frais pour le comptage. Pour effectuer un test de formation de colonie, après le tri, remettez les cellules en suspension dans un milieu complet et ajoutez le nombre approprié de cellules souches du cancer du sein dans chacun des trois tubes contenant deux millilitres de milieu par tube, étiquetés un fois 10 à la seconde, deux fois 10 à la seconde ou cinq fois 10 à la deuxième cellule. Pipette de haut en bas cinq fois pour bien mélanger la suspension cellulaire et plaquer les cellules dans les puits individuels d’une plaque à six puits.Faites tourner doucement la plaque pour obtenir une distribution cellulaire uniforme et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à l’apparition de colonies. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec un millilitre de PBS par puits et colorez les cellules avec 500 microlitres de solution de violet cristallin à 0,05 % par puits pendant 30 secondes. À la fin de l’incubation, laver les puits deux fois avec deux millilitres d’eau par puits pour éliminer l’excès de colorant, et compter et enregistrer le nombre total de colonies par puits par microscopie optique à un grossissement de quatre ou 10 fois.Pour effectuer un test de mammographie, après le tri, remettez les cellules en suspension dans un milieu de mammosphère complet et plaquez les cellules à une densité d’assise de cinq fois 10 des secondes cellules par centimètre carré de surface par puits dans une plaque de culture cellulaire à très faible fixation de 96 puits. Avant de compter le nombre de mammosphères par puits par microscopie optique, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq à 10 jours. Pour mettre en place un modèle de culture 3D, ajoutez soigneusement 50 microlitres d’extrait de membrane basale dans chaque puits d’une plaque de 96 puits sans bulles et placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la solution de polymériser.Ajoutez 100 microlitres de PBS après 10 minutes pour éviter le dessèchement de la couche de gel. À la fin de l’incubation, suspendre les cellules triées à cinq à 50 fois 10 à la troisième cellule par 200 microlitres de concentration de milieu de culture 3D et remplacer le PBS dans chaque puits de la plaque à 96 puits par 200 microlitres de milieu contenant des cellules. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 à 14 jours avant d’évaluer la formation d’organoïdes dans les cultures.Les cellules cancéreuses du sein humaines qui présentent une activité enzymatique ALDH accrue expriment des niveaux élevés de CD44 et des niveaux d’expression faibles à négatifs de CD24, et peuvent être classées comme cellules souches du cancer du sein. La proportion de cellules souches du cancer du sein dans la population en vrac peut varier entre les lignées cellulaires ou les patientes et dépend souvent du stade de la maladie, le cancer du sein plus agressif présentant généralement une proportion plus élevée de cellules souches du cancer du sein. La capacité d’une seule cellule cancéreuse du sein à s’auto-renouveler et à générer des colonies de 50 cellules peut être évaluée par des tests de formation de colonies.La capacité des cellules souches du cancer du sein à s’auto-renouveler dans des conditions expérimentales indépendantes de l’ancrage peut être évaluée par des tests de mammosphère. La culture de cellules cancéreuses du sein et d’extraits de membrane basale permet aux cellules souches du cancer du sein de former des structures 3D qui récapitulent les conditions in vivo. De plus, des modèles de xénogreffes de souris in vivo peuvent être utilisés pour comprendre les différences de croissance, d’auto-renouvellement, de différenciation et/ou de capacité d’initiation tumorale des cellules souches du cancer du sein par rapport aux cellules souches non cancéreuses du sein ou aux populations de cellules en vrac.À la suite de cette procédure, les cellules souches isolées du cancer du sein peuvent être utilisées dans des études transcriptomiques, kinomiques et métabolomiques. Cette méthode offre aux chercheurs l’occasion d’explorer le rôle des cellules souches du cancer du sein dans l’initiation de la tumeur, les métastases, la récidive et la résistance au traitement.

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Apprenez à isoler des cellules souches du cancer du sein humain à partir d'échantillons cellulaires et tissulaires. Cette méthode permet d'évaluer leur fonction in vitro et in vivo pour développer des stratégies thérapeutiques ciblées.

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

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