Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon
22 janvier 2021
Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.
Cette nouvelle méthode de cultures sphéroïdes peut être utilisée pour étudier la tumorigénicité pour analyser la présence de différentes populations de cellules souches cancéreuses et peut également être bien appliquée pour par le biais d’un dépistage élevé pour de nouveaux médicaments. Il s’agit d’un système de culture robuste et répétitif pour générer un grand nombre de sphéroïdes de taille homogène. De plus, ces sphéroïdes peuvent être utilisés pour étudier les cellules souches cancéreuses.
Cette méthode est mise en place pour étudier la biologie du cancer chronique, mais elle peut être facilement mise en place pour étudier d’autres cancers en modifiant les conditions de culture 3D. Assurez-vous de surveiller les bulles dans le milieu, de ne pas trop déplacer la plaque pendant la formation des sphéroïdes et d’être prudent lors de la récolte des sphéroïdes dans la passoire. Commencez par prétringer les puits d’une plaque de 24 puits avec 500 micro litres de solution de rinçage anti-adhérence par puits.
Après quelques secondes centrifuger la plaque dans le rotor à godet oscillant et rincer chaque puits avec 2 millilitres de milieu basal chaud. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles ont été complètement retirées des micro-puits. Si aucune bulle n’est observée, rincez à nouveau les puits avant d’ajouter un millilitre de milieu matriciel chaud de membrane de sous-sol DMEM à chaque puits.
Pour induire la formation de sphéroïdes, voir la concentration souhaitée de cellules Caco-2 dans une couche mono 2D dans un plat de 10 centimètres dans le DMEM complété avec 10% FBS et 1% antibiotiques. Pour la culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans une atmosphère humidifiée. Lorsqu’une confluence de 80% est atteinte, laver les cellules avec cinq millilitres de PBS avant de traiter la culture avec deux millilitres de Trypsine-EDTA pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de DMEM complet. Après comptage, recueillir les cellules par centrifugation et ressusciter la palette dans le volume approprié de milieu matriciel de membrane de sous-sol DMEM pour atteindre la concentration souhaitée de cellules dans un millilitre de milieu par puits. Ajoutez un millilitre de cellules à chaque puits de la plaque prépayée de 24 puits, suivi de l’ajout d’un millilitre de milieu matriciel de membrane de sous-sol DMEM à chaque puits.
Après l’ensemencement, centrifugez immédiatement la plaque et utilisez un microscope optique pour vérifier que les cellules ont été réparties uniformément dans les micro-puits. Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures sans perturber les cellules. Pour récolter les sphéroïdes, à la fin de l’incubation, utilisez une pipette sérologique et la moitié du surnageant dans chaque puits pour déloger doucement les sphéroïdes de leurs micro-puits.
Lorsque tous les sphéroïdes ont été détachés, utilisez la pipette pour transférer soigneusement les cultures 3D de chaque puits vers une passoire réversible de 37 microns au-dessus d’un tube conique de 15 millilitres. Lavez chaque puits trois fois avec un millilitre de milieu basal pré-feu par lavage pour collecter les sphéroïdes restants et ajoutez ces sphéroïdes supplémentaires à la passoire. Après le dernier lavage, vérifiez la plaque au microscope pour confirmer que tous les sphéroïdes ont été retirés des micro-puits.
Ensuite, inversez la passoire sur un nouveau tube de 15 millilitres et lavez le fond de la passoire avec un milieu de matrice de membrane de sous-sol DMEM frais pour recueillir les sphéroïdes dans le tube. Les sphéroïdes s’élèvent de 500 cellules démontrent l’augmentation la plus homogène de la taille au fil du temps. Avec 500 et 600 cellules par sphéroïde, déterminez le nombre optimal de cellules sous lesquelles une bonne croissance et une faible variabilité peuvent être obtenues.
L’ajout de la matrice de membrane de sous-sol améliore la croissance et l’homogénéité de sphéroïde. Dans la culture à long terme, les cellules apparaissent sous forme de multi-couches denses au troisième jour. Alors que les cellules aplatir disposées en couches mono sont clairement visibles au jour 10.
Fait intéressant, une lumière apparaît dans les sphéroïdes à partir du cinquième jour. En outre, une nette augmentation des cellules proliférantes cellules nucléaires antigène positif est observée aux jours cinq et sept qui diminue au jour 10. Étonnamment, Caspace activé 3 est observé dans très peu de cellules aux jours trois et cinq seulement.
Alors que des niveaux élevés d’expression de la bêta-caténoine sont observés à chaque point de temps. Le potentiel des sphéroïdes à se différencier en anterosites est démontré par leur phosphatase alcaline et soluté famille 2A5 ADN messagère expression. En outre, ces sphéroïdes expriment les marqueurs typiques de cellule souche de cancer et répondent aux traitements de chimiothérapie de combinaison habituellement administrés aux cancéreux côlorectaux.
Ainsi, les sphéroïdes sont composés de différentes populations cellulaires. Ils peuvent ensuite être bien utilisés pour analyser les réponses spécifiques des cellules aux stimuli tels que les réfractaires et éventuellement pour les réponses médicamenteuses.
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Aperçu
Ce protocole présente un système de culture robuste permettant la formation de sphéroïdes tridimensionnels à partir de cellules d'adénocarcinome du côlon Caco2. Cette méthode permet l'étude de la biologie des cellules souches cancéreuses et de leur réponse à la chimiothérapie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Comprendre les cellules souches cancéreuses est essentiel pour développer des thérapies efficaces.
- Les cultures en sphéroïdes tridimensionnelles imitent les environnements tumoraux in vivo.
- Cette méthode peut être adaptée à divers types de cancer.
- La robustesse et la reproductibilité sont essentielles pour la validité expérimentale.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode fiable pour la culture de sphéroïdes à partir de cellules Caco2.
- Étudier la tumorigénicité et les populations de cellules souches cancéreuses.
- Faciliter le criblage à haut débit de nouveaux médicaments.
Méthodes utilisées
- Prétraitement des puits avec une solution de rinçage anti-adhérence.
- Manipulation soigneuse afin d'éviter la formation de bulles durant la formation des sphéroïdes.
- Récupération des sphéroïdes à l'aide d'un tamis.
- Surveillance des conditions de culture pour une croissance optimale.
Résultats principaux
- Génération réussie de sphéroïdes de taille homogène.
- Applicabilité démontrée pour l'étude des cellules souches cancéreuses.
- Potentiel pour des applications de criblage pharmacologique.
- Adaptabilité à d'autres types de cancer en modifiant les conditions de culture.
Conclusions
- Cette méthode fournit un nouvel outil pour la recherche sur le cancer.
- Elle améliore la compréhension de la dynamique des cellules souches cancéreuses.
- De futures études pourront exploiter ce système pour le développement de thérapies.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce modèle de sphéroïde en 3D répond au besoin essentiel de systèmes précliniques capables de reproduire l'hétérogénéité tumorale et les phénotypes des cellules souches cancéreuses (CSC), permettant ainsi une évaluation plus prédictive des cibles thérapeutiques et des réponses aux médicaments dans la recherche sur le cancer colorectal. En offrant une plateforme reproductible pour l'enrichissement à long terme des CSC et l'évaluation de la réponse à la chimiothérapie, cette méthode soutient les efforts de validation précoce des cibles et d'identification de composés promoteurs, avec une meilleure confiance en leur transposition clinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'hétérogénéité des cellules souches cancéreuses et leur potentiel tumorigène grâce à des profils de prolifération différentiels et à la formation de structures semblables à des lumières au sein des sphéroïdes.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle de cibles thérapeutiques en enrichissant les cellules souches cancéreuses exprimant des marqueurs établis, ce qui permet de réduire les risques mécanistiques liés aux hypothèses thérapeutiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des sphéroïdes de taille homogène à partir d'entrées cellulaires définies, créant ainsi un système standardisé pour l'analyse quantitative de la réponse aux médicaments.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les flux de travail de criblage à haut débit en raison de sa robustesse, de sa reproductibilité et de la facilité de récolte des sphéroïdes par des méthodes utilisant des filtres.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre l'expression des marqueurs des CSC et leur réponse à une chimiothérapie combinée pertinente sur le plan clinique, permettant la modélisation préclinique de la résistance et de la sensibilité au traitement.
- Valeur opérationnelle : Préserve les phénotypes des CSC en culture à long terme, facilitant les études longitudinales sur l'efficacité des médicaments et les mécanismes de récidive tumorale.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification de composés actifs et à la validation préclinique, en particulier pour les programmes d'oncologie axés sur les thérapies ciblant les cellules souches cancéreuses et les mécanismes de résistance.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques et la réduction des risques biologiques en modélisant les niches des cellules souches cancéreuses et leurs réponses différentielles aux médicaments dans un contexte tridimensionnel.
- Essais de criblage : Permet la standardisation des tests grâce à la formation de sphéroïdes de taille homogène, soutenant ainsi un criblage fiable de composés sur des populations enrichies en cellules souches cancéreuses.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives par l'expression des marqueurs des cellules souches cancéreuses, des marqueurs de prolifération (PCNA) et des marqueurs d'apoptose (caspase-3 activée) afin de comparer différentes conditions de traitement.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en modélisant la réponse à la chimiothérapie dans un système pertinent pour la maladie, reflétant l'hétérogénéité des adénocarcinomes colorectaux.
- Réutilisation institutionnelle : Adaptable à d'autres types de cancer par modification des conditions de culture tridimensionnelle, ce qui en fait une plateforme réutilisable dans divers programmes de découverte en oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en capturant l'hétérogénéité tumorale induite par les cellules souches cancéreuses et les propriétés fonctionnelles de souche absentes dans les modèles en 2D.
- Valeur opérationnelle : Assure reproductibilité et évolutivité grâce à un ensemencement standardisé, un prétraitement anti-adhérent et une récolte basée sur des filtres, réduisant ainsi la variabilité dans la génération de sphéroïdes.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en permettant une évaluation précoce des composés ciblant les cellules souches cancéreuses et des mécanismes de résistance, réduisant les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des candidats-médicaments ajustée au risque, fondée sur des données de modulation des cellules souches cancéreuses et de réponse à la chimiothérapie issues d'un modèle physiologiquement pertinent.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de culture cellulaire en 3D, notamment le traitement de surfaces anti-adhérentes et une manipulation soigneuse afin d'éviter la formation de bulles lors de l'initiation des sphéroïdes.
- Dépend de l'accès à une matrice de membrane basale (par exemple, Matrigel) et à du matériel standard de culture cellulaire, y compris des centrifugeuses, des filtres (37 microns) et des microscopes inversés pour le suivi.
- Implique une standardisation inter-équipes de la densité d'ensemencement (500 à 600 cellules/sphéroïde) et du temps d'incubation afin d'assurer l'homogénéité et la reproductibilité entre les expériences.
- L'adaptation à d'autres types de cancer nécessite une optimisation de la concentration de la membrane basale et de la durée de culture, selon les cinétiques d'adhésion et de formation des sphéroïdes propres à chaque lignée cellulaire.
- Les limites pratiques incluent la nécessité d'une manipulation délicate lors de la récolte pour éviter la disruption des sphéroïdes, ainsi qu'une variabilité potentielle du moment de formation de la lumière entre les lots.
