Mesure de l’activité antifongique volatile et non volatile des produits de lutte biologique

Ce protocole fournit une méthode pour effectuer des comparaisons précises côte à côte de l’efficacité relative des composés antifongiques volatils et non volatils à différents stades de croissance fongique. Cette méthode est bien adaptée pour évaluer l’activité antifongique des produits d’origine végétale utilisés sous forme séchée ou liquide contenant une grande diversité de molécules. Cette méthode peut fournir des informations précieuses sur le mode d’application des produits d’origine végétale et est particulièrement bien adaptée dans le domaine de la lutte biologique.

Valentina Gligorijevic, assistante ingénieur du laboratoire Sup’Biotech, fera la démonstration de la procédure. Pour la collecte des conidies, superposez trois millilitres de 0,05 % de Tween 20 sur une culture de mycélium de trichoderma et utilisez un râteau pour libérer les conidies des conidiophores en prenant soin de ne pas appuyer sur le mycélium pour éviter que les hyphes ne soient arrachés. Lorsque toutes les conidies ont été libérées, utilisez une micropipette pour récupérer rapidement et ajoutez la solution de conidies dans un tube de 15 millilitres pour compter.

Pour préparer des plaques fongiques, déposez 100 microlitres de spores à une concentration de trois fois 10 à six spores par millilitre sur une boîte de Pétri de neuf centimètres contenant un milieu PDA, et utilisez une spatule stérile pour ajouter 10 grammes de billes de verre de deux millimètres de diamètre dans la plaque. Ensuite, secouez doucement la plaque d’avant en arrière et tournez et tournez la plaque en segments de 90 degrés jusqu’à ce qu’elle ait été complètement tournée pour répartir uniformément les spores sur la surface de la gélose. Ensuite, incubez la plaque à 30 degrés Celsius jusqu’à l’analyse d’inhibition de croissance.

Pour effectuer un essai d’inhibition de contact avec de la poudre d’ail, utilisez une spatule stérile pour peser la quantité désirée de poudre d’ail dans des tubes individuels de 50 millilitres. Pour obtenir des concentrations variant généralement de 0,25 à 16 milligrammes par millilitre. Ajoutez 10 millilitres d’environ 45 degrés Celsius PDA dans chaque tube et retournez soigneusement chaque tube plusieurs fois pour répartir uniformément la poudre dans l’agar.

Versez rapidement les suspensions homogénéisées dans des boîtes de Pétri de cinq centimètres de diamètre et laissez la gélose se solidifier à température ambiante. Pour effectuer un test d’inhibition de contact, utilisez un tube stérile en acier inoxydable de cinq millimètres de diamètre pour tracer un cercle au centre de la gélose dans les boîtes de contrôle et traitées avec des composés antifongiques, et utilisez un cure-dent stérile pour éliminer les cylindres de gélose. Ensuite, utilisez un nouveau tube en acier inoxydable de cinq millimètres de diamètre pour tracer 15 à 20 cercles au hasard dans les plaques fongiques, et utilisez des cure-dents stériles pour transférer soigneusement les cylindres recouverts de spores, d’hyphes ou de mycélium dans les régions vides des plaques PDA.

Remettez ensuite les plaques dans l’incubateur à 30 degrés Celsius. Pour préparer une plaque pour un essai d’inhibition antifongique en phase vapeur, versez 10 millilitres de milieu PDA dans le couvercle d’une boîte de Pétri de cinq centimètres de diamètre contenant 10 millilitres de milieu PDA contenant des composés antifongiques ou un milieu PDA seul, et laissez la gélose se solidifier à température ambiante. À l’aide d’un tube centrifuge de 50 millilitres comme outil de calibrage, faites un cercle de PDA au centre de la gélose et utilisez une spatule stérile pour retirer la gélose autour du cercle.

Utilisez un tube stérile en acier inoxydable de cinq millimètres de diamètre pour tracer un cercle au centre du milieu dans le couvercle et utilisez un cure-dent stérile pour jeter le cylindre de la tarière. Ensuite, utilisez un tube stérile en acier inoxydable de cinq millimètres de diamètre pour faire des bouchons au hasard dans les plaques fongiques préparées, et utilisez un cure-dent stérile pour transférer soigneusement les bouchons de spores, d’hyphes ou de mycélium dans les couvercles des plaques de test. Dans cette analyse, l’inhibition de la croissance de l’espèce trichoderma SBT 10-2018 déclenchée par trois composés antifongiques a été évaluée à l’aide d’essais d’inhibition par contact et en phase vapeur, comme démontré pour chaque stade fongique.

Une sensibilité plus élevée des spores au carbendazime a été observée par rapport aux réseaux précoces d’hyphes et de mycélium lorsque le trichoderma et les composés antifongiques étaient en contact. En revanche, le carbendozim n’a pas eu d’effet antifongique sur le trichoderma lorsque le champignon a été placé à une certaine distance du fongicide, compte tenu de la faible volatilité de cette substance. Lorsque l’huile essentielle de thymus vulgaris a été utilisée comme composé antifongique, une sensibilité plus élevée a été observée pour les spores et les hyphes précoces par rapport à l’inhibition de la croissance du mycélium à 0,025 % d’huile essentielle.

Comme prévu, l’huile essentielle de thymus vulgaris présentait une activité antifongique identique, quelle que soit la distance entre le champignon et l’huile. Lorsque la poudre d’ail a été utilisée, une efficacité plus élevée a été observée contre la germination des spores et l’allongement précoce des hyphes que pour la croissance du mycellium. Une attention particulière doit être portée lors de la préparation de la plaque fongique pour s’assurer que les spores sont uniformément réparties à la surface de la plaque de gélose afin d’assurer des résultats comparables.