Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

La peptoglycomique utilise une spectrométrie de masse avancée combinée à une analyse de données bio-informatiques de haute puissance pour examiner la composition du peptidoglycane dans les moindres détails. L’utilisation d’algorithmes bioinformatiques permet l’analyse, l’extraction et la comparaison de données de spécification de masse dans une collection de fichiers de données simultanément, ce qui réduit la charge de travail et augmente la précision. La compréhension des diverses variations et modifications du peptidoglycane a des implications dans la compréhension des processus cellulaires, notamment la croissance et la division, l’évasion immunitaire de l’hôte et la résistance aux antimicrobiens.

Nous recommandons de préparer et d’analyser d’abord un petit sous-ensemble d’échantillons pour se familiariser avec le protocole et servir de projet pilote pour évaluer les paramètres expérimentaux. Étant donné que les logiciels d’analyse de données de spectrométrie de masse varient souvent dans les définitions utilisées pour décrire les caractéristiques et les fonctions, la démonstration visuelle aidera les utilisateurs à appliquer ce protocole sur toutes les plateformes. Pour l’extraction du peptidoglycane sacculi, remettre en suspension les pastilles cellulaires congelées à environ un à 10 du volume de culture d’origine dans du phosphate de sodium de 20 millimolaires à quatre degrés Celsius avant d’ajouter la suspension cellulaire goutte à goutte jusqu’à ébullition de 8 % de SDS dans du phosphate de sodium de 20 millimolaires jusqu’à un volume final de type un à un.

Maintenez une ébullition douce pendant 30 minutes à trois heures en remuant pour assurer une dissociation complète de la membrane. Le mélange résultant doit être complètement clair, sans amas de cellules restants ni viscosité. Lorsque la solution a refroidi à température ambiante, recueillir les sacculi par ultra-centrifugation, suivie de cinq à sept lavages dans environ 50 millilitres de phosphate de sodium à température ambiante et de 20 millimolaires par lavage jusqu’à ce que le tampon de lavage ait une concentration de SDS d’environ 0,001 %, déterminée par colorant colorimétrique.

Après le dernier lavage, remettre les sacculus en suspension dans 5 à 10 millilitres de phosphate de sodium 20 millimolaires à température ambiante et compléter l’échantillon avec 50 microgrammes par millilitre d’amylase, de DNase et de RNase dans 10 millimolaires de sulfate de magnésium pour une incubation d’une heure avec agitation ou nutation à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, digérez la réaction pendant la nuit avec 100 microgrammes par millilitre de pronase à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, après l’ultra-centrifugation, faites bouillir l’échantillon pendant une heure dans 25 millilitres de 2 % de SDS et 20 millimolaires de phosphate de sodium dans un cuiseur vapeur.

À la fin de l’incubation, laver l’échantillon cinq à sept fois avec 50 millilitres d’eau bidistillée à température ambiante, comme démontré. Lorsque la concentration de SDS atteint environ 0,001 %, remettre le granulé en suspension dans une quantité suffisante d’eau double distillée pour obtenir une suspension de sacculi et laver le récipient. Après une nuit de stockage à moins 80 degrés Celsius, lyophilisez l’échantillon congelé avant de diluer les sacculi à 10 milligrammes de peptidoglycane par millilitre de concentration d’eau distillée double.

Pour l’analyse LC-MS, démarrez un nouveau projet dans le logiciel de l’instrument et attribuez les fichiers de données LC-MS QTOF appropriés à la condition expérimentale d’intérêt. Exécutez l’extraction de caractéristiques récursives par lots de l’assistant de traitement de données et définissez les filtres de traitement des données pour qu’ils correspondent aux paramètres des conditions LC-MS et de l’instrumentation afin d’identifier, de regrouper et de vérifier avec précision les pics de masse à charge représentant des muropeptides individuels. Examinez les résultats à la fin de l’extraction de la fonctionnalité.

Si un nombre important de fonctions n’ont pas réussi à s’aligner dans un groupe, ajustez les paramètres de filtrage récursif pour élargir ou restreindre la fenêtre de détection si nécessaire. Exportez ensuite les données sous forme de fichier d’échange composé. Pour l’analyse différentielle des caractéristiques spectrales, démarrez un nouveau projet dans le logiciel système et suivez les instructions pour l’importation des données.

Au cours de l’analyse des données, sélectionnez la signification et le changement de pli pour l’analyse différentielle, puis définissez les données de référence sur l’intensité médiane dans tous les fichiers de données. Une fois l’analyse terminée, examinez les analyses graphiques et statistiques qui en résultent afin d’identifier les muropeptides qui démontrent un changement significatif de l’abondance entre les conditions expérimentales testées. Sous le navigateur de projet, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les différentes analyses et sélectionnez une option d’exportation pour enregistrer les détails de la caractéristique sous forme de fichier tsv.

Assurez-vous de sauvegarder plusieurs analyses pour obtenir toutes les données pertinentes. Dans le logiciel d’analyse différentielle, sous Interprétation des résultats, sélectionnez Navigateur d’ID, ajoutez une bibliothèque de structures muropeptides attendues et sélectionnez des paramètres similaires à ceux démontrés pour l’extraction de caractéristiques afin de produire une annotation muropeptide prédite pour chaque caractéristique identifiée. Pour confirmer manuellement l’annotation prédite du muropeptide, comparez les pics du rapport masse/charge du chromatogramme de spectrométrie de masse en tandem au rapport masse/charge prévu de toutes les fragmentations possibles d’une structure muropeptide connue.

Utilisez un éditeur moléculaire pour dessiner la structure muropeptide prédite à l’aide de l’outil de fragmentation de masse pour montrer le rapport masse/charge des fragments de spectrométrie de masse lorsque chaque liaison est rompue individuellement ou en combinaison, puis comparez toutes les fragmentations possibles de la structure muropeptide au chromatogramme de spectrométrie de masse en tandem. Pour confirmer l’annotation du muropeptide, les pics de rapport masse/charge de plusieurs fragments doivent être trouvés dans le chromatogramme de spectrométrie de masse en tandem avec une fenêtre d’alignement du rapport masse/charge très minimale. Pour évaluer les changements globaux dans les modifications du muropeptide, modifiez le fichier tsv du muropeptides statistiquement significatif à changement élevé afin d’inclure une seule colonne pour chaque modification du muropeptide.

Remplissez cette colonne avec une désignation pour chaque muropeptide annoté et téléchargez le fichier tsv modifié dans Perseus. Sous Annoter les lignes, cliquez sur Annoter catégoriquement les lignes et ajouter des fichiers de données à chaque paramètre expérimental. Ensuite, sous test, cliquez sur deux exemples de tests pour effectuer le test T d’un étudiant et cliquez sur 1D pour effectuer une annotation 1D.

Une sensibilité de détection accrue des machines de spectrométrie de masse, associée à un logiciel de reconnaissance de pics haute puissance, a amélioré la capacité d’isoler, de surveiller et d’analyser la composition des substances d’échantillons complexes dans les moindres détails. L’association de chaque pic masse-charge extrait des données de spectrométrie de masse à un muropeptide particulier est facilitée par le recoupement avec une base de données de structures de muropeptide connues et prédites. Le chromatogramme de spectrométrie de masse en tandem de fragmentation pour chaque caractéristique extraite peut être comparé au profil de fragmentation du muropeptide proposé à l’aide de la base de données.

Les graphiques volcaniques peuvent être utilisés pour mettre en évidence les muropeptides qui démontrent une amplitude statistiquement significative de changement d’abondance entre les conditions testées. Lorsqu’ils sont examinés ensemble, plusieurs muropeptides possédant la même modification peuvent être examinés pour une tendance vers une condition expérimentale et l’ensemble du groupe peut être évalué pour sa signification. Le suivi d’une modification du muropeptide de cette manière permet d’identifier une activité enzymatique particulière qui est affectée par le paramètre expérimental.

De plus, les valeurs aberrantes de cette tendance peuvent révéler des activités enzymatiques avec une spécificité ou une fonction biologique particulière. Cette procédure examine les changements biochimiques et les variations biologiques dans les polymères, donnant ainsi un aperçu de l’activité enzymatique travaillant sur le PG in vivo. L’examen de la composition du PG en vérifiant les détails aidera à la compréhension des structures cellulaires complexes, ce qui a des implications pour de nombreux processus physiologiques critiques.