Dissection assistée par transillumination d’étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de la souris pour les analyses d’immunostaining en aval

Cette méthode facilite l’identification et la dissection de segments trompeux séminifères spécifiques à un stade, permettant l’étude d’étapes très spécifiques de la spermatogenèse. Les étapes du cycle épithélial séminifère peuvent être reconnues dans les tubules frais et non fixés, et, par conséquent, nous ne pouvons sélectionner que les étapes d’intérêt pour les analyses en aval. Il faut un peu de pratique pour apprendre à reconnaître les étapes sur la base de leurs modèles de transillumination, mais ce protocole devrait assurer votre succès.

La démonstration de la procédure sera faite par Opeyemi Olotu, qui est doctorant dans mon laboratoire. Commencez par placer une souris mâle adulte d’au moins 8 semaines en position couchée et désinfectez l’abdomen ventral avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux stériles pour faire une incision en forme de V dans la région pelvienne abdominale et utilisez des pinces stériles pour tirer sur le coussinet adipeux de l’épididyme afin de localiser les testicules.

Utilisez des ciseaux pour disséquer les testicules, en plaçant les tissus dans une boîte de Pétri stérile de 100 millimètres avec PBS au fur et à mesure qu’ils sont récoltés. Utilisez des ciseaux à pointe fine pour couper une fente dans la tunique albuginée, l’épaisse feuille fibreuse encapsulant les testicules, et utilisez une pince pour déchirer la tunique et forcer les tubules à sortir. Placez les tubes séminifères décapsulés dans une nouvelle boîte de Pétri et ajoutez suffisamment de PBS stérile pour couvrir le fond de la boîte.

Ensuite, à l’aide de la pince, écartez doucement les tubules sans endommager les tissus. Pour la dissection des tubules, collez la parabole sur une platine de microscope à dissection et activez la transillumination. À l’aide d’une pince fine, déplacez avec précaution les faisceaux de tubules afin de vous familiariser avec les modèles d’absorption et de diffusion de la lumière des différentes étapes.

Ensuite, utilisez une pince à pointe crochue pour soulever un tubule d’intérêt et utilisez des ciseaux de microdissection pour couper un segment d’une longueur appropriée. Après avoir coupé les segments de tubules spécifiques à l’étape, utilisez une pipette pour prélever un segment d’intérêt dans un volume de 10 microlitres de PBS et placez le segment sur une lame de microscope. Appuyez avec précaution un verre de couverture de 20 x 20 millimètres sur le tubule sans trop écraser les cellules et placez la lame sur la platine d’un microscope à contraste de phase.

Placez un papier filtre sur le bord du verre de protection pour faciliter l’étalement des cellules en une monocouche et utilisez l’objectif 40 fois pour vérifier les étages cellulaires. Une fois que les cellules ont formé une monocouche ronde aux deux extrémités du tubule, trempez la lame dans un récipient d’azote liquide pendant 10 secondes. À l’aide d’un scalpel, retournez le verre de couverture des cellules et placez immédiatement la lame dans de l’éthanol à 90 % pendant 2 à 5 minutes.

Ensuite, séchez à l’air libre et conservez la lame à température ambiante jusqu’à plusieurs jours. Pour l’immunocoloration complète des tubes séminifères, utilisez une pipette pour transférer les segments d’intérêt dans un tube conique de 15 millilitres de PBS glacé sur glace. Après avoir laissé les segments sédimenter, retirez soigneusement le PBS.

Ajouter 10 millilitres de PBS frais glacé et mélanger par inversion. Laissez les tubules se déstabiliser pendant quelques minutes avant de retirer à nouveau le surnageant comme démontré. Lorsque tout le surnageant a été éliminé, fixez les tubules dans 5 millilitres de paraformaldéhyde pendant cinq heures à 20 à 30 tours par minute à 4 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laissez les tubules se déposer pendant quelques minutes avant de laver l’échantillon trois fois dans du PBS frais à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes par lavage avec rotation. Après le dernier lavage, utilisez une pipette de 1 millilitre pour transférer 10 à 20 segments de tubules fixes dans un tube à fond rond de 2 millilitres. Lorsque les segments se sont stabilisés, remplacer le surnageant par 1 millilitre de 2 % BSA et 10 % FBS dans du PBSX pour une incubation d’une heure à température ambiante et 20 à 30 tours par minute.

À la fin de l’incubation bloquante, laver les échantillons avec 1 millilitre de PBSX. Avant de marquer les tubules avec 250 microlitres d’anticorps primaires, diluez-le dans 1 % BSA dans du PBSX pendant deux heures à température ambiante à 20 à 30 tours par minute. À la fin de l’incubation, laver les tubules trois fois dans du PBSX comme démontré avant d’étiqueter les échantillons avec 250 microlitres d’anticorps secondaires appropriés pendant une heure, à l’abri de la lumière à température ambiante et de 20 à 30 tours par minute.

À la fin de l’incubation, laver les tubules trois fois avant de les décanter sur une lame de microscope dans un petit volume de surnageant. Ensuite, à l’aide d’embouts de chargement de gel, disposez les tubules en bandes linéaires et égouttez l’excès de tampon. Ensuite, ajoutez 1 à 2 gouttes de support de montage avant de monter la diapositive avec une lamelle.

Sous transillumination, les stades 7 à 8 apparaissent uniformément sombres car ils contiennent un grand nombre de spermatides allongées entièrement condensées qui sont alignées à la surface apicale de l’épithélium. Après que les spermatozoïdes matures ont été libérés dans la lumière pendant la spermation, le tubule apparaît très pâle aux stades 9 et 10 en raison de l’absence de spermatides allongées condensées dans l’épithélium. Cette zone pâle est suivie de la zone faible, dont l’aspect tacheté provient de l’organisation de spermatides allongées avec de la chromatine condensée en faisceaux.

Ces faisceaux deviennent très proéminents dans la zone de forte tache subséquente. Les faisceaux de spermatides migrent vers les noyaux cellulaires de Sertoli qui sont situés près de la lame basale, ce qui se traduit par un aspect rayé des tubules de stade 2 à 5 lorsqu’ils sont transilluminés. Les faisceaux se dispersent finalement au stade 6, et les spermatides allongées qui se condensent se déplacent près de la lumière pour être libérées de l’épithélium au stade 8.

L’étape exacte du segment de tubule peut être vérifiée avec précision par microscopie à contraste de phase des préparations de courges. L’immunomarquage de préparations de courge étagé peut être utilisé pour étudier l’expression et la localisation des protéines d’intérêt dans l’épithélium séminifère. La coloration à montage entier du tube séminifère est généralement utilisée pour étudier les types de cellules qui sont en contact avec la membrane basale de l’épithélium séminifère, soit du côté tubulaire ou interstitiel.

La méthode peut également être utilisée pour étudier les cellules ou les structures situées plus profondément dans l’épithélium, telles que la barrière hémato-testiculaire ou les cellules germinales post-méiotiques. En plus de l’immunomarquage, nous pouvons utiliser des segments tubaires à plusieurs étages pour de nombreuses autres analyses en aval, y compris les dosages biochimiques d’ARN et de protéines, la cytométrie en flux et la culture tubaire ex vivo. Parce que cette méthode permet une analyse très détaillée de la spermatogenèse, elle fournit vraiment un outil utile pour étudier tous les processus importants nécessaires à la production de spermatozoïdes et à la fertilité masculine.