Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë
21 février 2021
Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.
Ce protocole montre deux façons distinctes de détecter NKG2DLs sur la surface des cellules AML. La technique fournit une méthode de coloration rapide et conviviale pour détecter tous les NKG2DLs connus et éventuellement inconnus. Cette méthode permet de séparer les cellules souches leucémiques des cellules de la LAM en vrac, ce qui permet de caractériser davantage ces cellules.
Commencez par décongeler la biotine et les tubes protéiques de fusion NKG2D à température ambiante. Faites tourner rapidement la poudre NKG2D FC, puis ajoutez 500 microlitres de PBS pour reconstituer la poudre et mélangez bien à l’aide d’une micropipette P-1000. Ajouter 100 microlitres de la protéine de fusion NKG2DL à un tube de biotine pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, et bien mélanger la solution avec une micropipette P-100.
Pour décongeler les cellules de la LAM, retirez le cryovial contenant la LAM primaire du stockage d’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Déplacez doucement le tube d’avant en arrière dans l’eau, ce qui permet au contenu du flacon de dégeler jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans le tube contenant le milieu et rincer le flacon à l’aide d’un millilitre de milieu.
Centrifuger les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes et jeter le surnageant sans perturber le culot. Laver les cellules avec cinq millilitres de milieu RPMI contenant 10% FCS et répéter la centrifugation. Ressusciter le culot cellulaire avec un tampon de coloration à une concentration finale de 0,5 fois 10 à la septième cellule par millilitre.
Puis transférer 100 microlitres de la suspension cellulaire vers une culture cellulaire 96 puits U-bottom plaque et centrifuger la plaque à 300 fois G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant sans déranger la pastille. Préparer un mélange maître de protéine de fusion NKG2D biotinylée afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 microlitres par puits avec une concentration finale de NKG2D de 10 microgrammes par millilitre par puits.
Ajouter le mélange maître préparé et ressusciter les pastilles de la cellule avec une pipette de 200 microlitres. Incuber et centrifuger la plaque comme décrit dans le manuscrit du texte. Préparer un mélange maître à l’aide de streptavidine PE afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 microlitres.
Ajoutez le mélange maître aux cellules et ressuscitez les pastilles avec une pipette multicanal de 300 microlitres. Après avoir centrifugé la plaque et jeté le surnageant, utilisez une micropipette multicanal de 300 microlitres pour ressusciter les pastilles cellulaires dans 200 microlitres de tampon de coloration plus 7-AAD. Ensuite, analysez les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux.
Les échantillons analysés de la LAM sont positifs pour CD34 et NKG2DL, mais il existe également des sous-populations négatives, avec quatre populations différentes au total. La stratégie de gating typique commence par la sélection de la population principale de cellules via leur FSC et SSC. Les doublets et les cellules mortes sont exclus de l’analyse en aval.
Les barrières sont ajustées à l’aide de contrôles FMO pour assurer une identification appropriée des cellules positives. Les intensités de fluorescence des cellules positives pour CD34 par rapport à NKG2DL sont mises en évidence ici. Les cellules de la LAM qui sont positives pour CD34 montrent une expression de surface inférieure de NKG2DL, ce qui indique que l’expression de NKG2DL est associée à un manque de stemness.
Trois échantillons primaires d’AML ont démontré des événements positifs 19,8, 49,8, et 89,4% pour la souillure de protéine de fusion contre 20,4, 50,4, et 90,6% pour la souillure groupée d’anticorps d’anti-NKG2DL. D’autre part, la souillure simple de ligand a montré une gamme d’événements positifs jusqu’à 92% avec les pourcentages variant basés sur le ligand. Lorsque vous essayez cette méthode, il est très important d’être rapide lors de la décongélation des cellules primaires de la LAM, car elles sont fragiles et peuvent mourir facilement au cours de cette étape.
Après avoir effectué ce protocole, un tri de cellules basé sur le signal NKG2DL peut être effectué pour étudier plus en détail les populations.
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Aperçu
Ce protocole présente deux méthodes de coloration distinctes permettant la détection des ligands du récepteur NKG2D (NKG2DL) sur des échantillons primaires humains de leucémie aiguë myéloïde (LAM). Ces techniques permettent de séparer les cellules souches leucémiques des cellules LAM globales en vue d'une caractérisation ultérieure.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Oncologie
Contexte
- Les ligands du NKG2D sont importants pour la reconnaissance immunitaire dans le cancer.
- La leucémie myéloïde aiguë (AML) présente des défis en matière de caractérisation cellulaire.
- Les méthodes actuelles peuvent ne pas distinguer efficacement les cellules souches leucémiques.
- De nouveaux protocoles de coloration peuvent améliorer les capacités de détection.
Objectif de l'étude
- Développer des protocoles de coloration efficaces pour la détection des NKG2DL.
- Faciliter la séparation des cellules souches leucémiques des cellules AML globulaires.
- Améliorer la caractérisation des échantillons de LAM.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une protéine de fusion pour reconnaître les NKG2DL.
- Application de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.
- Décongélation et reconstitution de la biotine et de la protéine de fusion NKG2D.
- Mélange des solutions pour obtenir les concentrations souhaitées pour la coloration.
Résultats principaux
- Les deux protocoles détectent efficacement les NKG2DL connus et inconnus.
- La séparation des cellules souches leucémiques des cellules AML globales est réalisée.
- Les méthodes sont conviviales et rapides.
- Une caractérisation améliorée des cellules AML est possible.
Conclusions
- De nouveaux protocoles de coloration améliorent la détection des NKG2DL.
- Ces méthodes peuvent contribuer à la compréhension de la biologie de la LAM.
- Des recherches ultérieures pourront s'appuyer sur ces techniques pour obtenir des informations thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La distinction des cellules souches leucémiques par rapport aux populations globales de LAM reste un défi critique dans la validation des cibles et le développement de modèles précliniques. La capacité d'isoler des sous-populations négatives pour les NKG2DL dotées de propriétés de cellules souches permet une détection mécanistique des risques associés aux hypothèses thérapeutiques et renforce la confiance prédictive dans les flux de travail de découverte précoce. Cette approche oriente directement le tri du portefeuille en identifiant des systèmes pertinents pour la maladie possédant un potentiel tumorigène plus élevé.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en isolant les cellules souches leucémiques selon leur expression membranaire des ligands de NKG2D.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode rapide et conviviale pour distinguer les sous-populations ayant des caractéristiques de cellules souches des cellules de LAM différenciées.
- Valeur scientifique : Soutient la détection biologique des risques grâce à la validation fonctionnelle des propriétés des cellules souches dans les fractions négatives pour NKG2DL.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des résultats quantitatifs par cytométrie en flux permettant de comparer l'expression des NKG2DL selon des approches de marquage spécifiques aux ligands ou pan-ligands.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles de marquage reproductibles et standardisés, compatibles avec la préparation de criblages à haut débit.
- Valeur scientifique : Permet la préparation de systèmes biologiques validés pour des études de criblage de composés et d'engagement de cibles en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite l'alignement translationnel des biomarqueurs en associant la suppression des NKG2DL à des mécanismes d'évasion immunitaire dans les cellules souches leucémiques.
- Valeur opérationnelle : Assure la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en permettant l'isolement des cellules initiatrices de la maladie.
- Valeur scientifique : Renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en utilisant le statut des NKG2DL pour stratifier les sous-populations de LAM présentant un potentiel tumorigène différentiel.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation de la cible jusqu'à l'identification des composés candidats et l'évaluation préclinique, en permettant l'isolement de sous-populations définies mécanistiquement.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en séparant les cellules souches leucémiques (LSC) négatives pour les ligands du NKG2D des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) positives pour les ligands du NKG2D.
- Depistage : Assure la préparation des tests grâce à une détection quantitative normalisée de la surface cellulaire, compatible avec les plateformes de dépistage basées sur la cytométrie en flux.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (pourcentage d'événements positifs, intensité de fluorescence) permettant la comparaison des méthodes de marquage et des fréquences des sous-populations.
- Recherche translationnelle : Permet une continuité préclinique en facilitant l'isolement des LSC pour une validation fonctionnelle dans des modèles pertinents de la maladie.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une capacité réutilisable d'enrichissement des cellules souches, applicable à divers échantillons de LMA et adaptable à d'autres types de cancer présentant des mécanismes similaires d'évasion immunitaire.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans l'enrichissement des cellules souches, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans l'identification des cellules souches leucémiques.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et possibilité de généralisation de la détection des ligands de NKG2D sur plusieurs échantillons de LAM.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller/arrêt dans la validation des cibles, efficacité du capital grâce à une réduction précoce des risques, diminution du risque biologique en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur le potentiel d'enrichissement des cellules souches leucémiques et le phénotype d'évasion immunitaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux, en marquage cellulaire et en manipulation d'échantillons primaires de LAM.
- Dépend de l'accès à des cytomètres en flux, à du matériel de centrifugation et à des réactifs incluant la biotine, la protéine de fusion NKG2D, la streptavidine-PE et le 7-AAD.
- Exige une standardisation inter-équipes des stratégies de gating, des contrôles FMO et des réglages de compensation pour des résultats cohérents.
- Requiert des ajustements lors de l'application à différents systèmes modèles en raison de la variabilité des profils d'expression des ligands de NKG2D.
- Les limites pratiques incluent la fragilité des cellules primaires de LAM lors du décongélation, nécessitant une manipulation rapide pour préserver leur viabilité.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
