Name: Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Découvrez la culture d'organoides 3D à partir de villosités intestinales dédifférenciées chez la souris. Cette méthode par grattage préserve le mésenchyme pour étudier la régénération et la biologie des cellules souches.

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Cette publication a été soutenue par le numéro de prix K22 CA218462-03 du NIH National Cancer Institute. Les cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1 ont été un don généreux du Dr Michael P. Verzi.

Toutes les expériences menées sur des souris, y compris l’utilisation du tamoxifène et l’euthanasie par luxation cervicale, ont reçu l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut d’echnologie Stevens.
1. Souris
NOTE : La génération de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Des souris Villin-CreERT2 ont déjà été décrites3. Des souris femelles adultes âgées de huit à douze semaines ont été utilisées.
<ol><li>Induire la mutation Smad4KO:β-caténineGOF dans le Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 avec injection intrapéritonéale de tamoxifène dans l’huile de maïs pendant quatre jours consécutifs.</li>
	<li>Sacrifier la luxation cervicale de la souris dix jours après la première injection de tamoxifène.</li>
	<li>Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure de souris de pénétrer dans la cavité péritonéale.</li>
	<li>Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux à dissection pour exposer l’intestin. Isolez l’intestin à l’aide des ciseaux et des pinces. NOTE: La perte concomitante de Smad4 et le gain de mutation fonctionnelle de la β-caténine (Smad4KO;β-caténineGOF) dans l’épithélium intestinal ont été obtenus par injectionde Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Souris Villin-CreERT2 tous les jours pendant quatre jours consécutifs avec 0,05 g de tamoxifène / kg de poids corporel dans l’huile de maïs. Ces souris sont récoltées dix jours après la première injection de tamoxifène pour assurer la présence de cellules exprimant des marqueurs associés aux cellules souches dans les villosités dédifférenciées.</li>
</ol>2. Isolement et préparation du duodénum
<ol><li>Disséquer la moitié proximale du duodénum.</li>
	<li>Rincez le duodénum avec 5 mL de PBS glacé dans une seringue de 10 mL pour dégager le contenu luminal.</li>
	<li>Ouvrez le duodénum longitudinalement avec un ciseau incliné et posez le duodénum à plat sur une plaque de Petri de 15 cm sur de la glace avec la lumière du duodénum face à l’opérateur.</li>
</ol>3. Isolation des villosités par raclage
<ol><li>Avant de commencer le raclage, placez une passoire à mailles de 70 μm dans l’un des puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits. Remplissez tous les puits avec 4 mL de 1x PBS et placez la plaque de culture tissulaire de 6 puits sur de la glace (Figure 1).</li>
	<li>Grattez les villosités comme suit à l’aide de deux lames de verre microscopiques : l’une pour maintenir le duodénum vers le bas et l’autre pour gratter (Figure 1B1).<ol>
<li>Gratter le côté luminal du duodénum superficiellement deux fois pour éliminer le mucus. Appliquez une pression telle que cette étape élimine la couche de mucus, mais pas les villosités.</li>
		<li>Gratter à nouveau le duodénum, en appliquant deux fois la même pression que dans 3..1, au cours de laquelle on peut voir des villosités s’accumuler sur les diapositives (Figure 1B2). C’est la pression optimale (qui doit être déterminée empiriquement par l’opérateur) pour donner les villosités sans les cryptes attachées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez une pipette de transfert de 1 mL contenant du PBS pour transférer les villosités (qui sont recueillies sur la glissière de l’étape 3.2.2.) vers une passoire à mailles de 70 μm placée dans une boîte à 6 puits. Les villosités sont ainsi collectées après chaque éraflure (Figure 1B2).</li>
	<li>Laver les villosités recueillies dans la passoire de 70 μm (à partir de l’étape 3.3) en transférant la passoire (avec les villosités) à travers une série de puits dans un plat de 6 puits contenant du PBS froid (~ 4 mL/puits). Il s’agit d’enlever les cryptes lâches, le cas échéant.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette p1000, transférer la suspension de villosités en PBS (~ 3 mL) de la passoire de 70 μm vers un nouveau tube de 15 mL sur glace.</li>
	<li>Utilisez une pointe de pipette p200 à 0,1 % enduite de BSA pour aspirer un volume de 50 μL de la suspension à villosités sur une glissière en verre. Compter le nombre de villosités dans la gouttelette de 50 μL sous grossissement 4x pour déterminer la concentration de villosités dans la suspension PBS. Par exemple, s’il y a 10 villosités dans la suspension de 50 μL examinée, la concentration en villosités est de 0,2 villosités/μL. C’est aussi le moment de confirmer l’absence de cryptes attachées.</li>
	<li>Calculer le volume de suspension de villosités requis pour plaquer à une concentration de 0,5 villosités/μL de matrice BME-R1. Ajouter 100 μL supplémentaires pour tenir compte de l’erreur de pipetage et du volume requis pour l’examen microscopique requis pour assurer la pureté des villosités. ATTENTION: La pression utilisée dans les deux premières éraflures, qui élimine le mucus mais pas les villosités, doit être utilisée dans les éraflures suivantes au cours desquelles les villosités seront libérées. Limitez le nombre de grattements aller-retour à deux après la première observation de la libération des villosités. Cette mesure évite la libération de villosités avec les cryptes attachées. Il est essentiel d’évaluer microscopiquement les villosités pour s’assurer de l’absence des cryptes attachées.</li>
</ol>4. Placage des villosités sur la matrice BME-R1
<ol><li>À l’aide d’une pointe de pipette p200 émoussée revêtue de BSA à 0,1 %, transférez dans un tube de microcentrifugation le volume de villosités (à partir de l’étape 3.6) nécessaire à la plaque à une densité de ~ 6 villosités par puits dans 12,5 μL de matrice BME-R1. L’utilisation d’une pointe émoussée revêtue de BSA à ce stade garantit que les villosités, qui sont trop grandes pour une pointe pointue, sont aspirées sans être bloquées ou perdues d’être collées sur les côtés de la pointe.</li>
	<li>Faire tourner les villosités pendant 2 min à 200 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C) et retirer le surnageant.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.2 pour retirer tout PBS résiduel et passez à l’étape suivante sous une hotte à flux laminaire.</li>
	<li>Remettez ensemencez doucement la pastille dans la quantité requise de BME-R1 froid décongelé sur de la glace.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette p20, plaque 12,5 μL/puits des villosités dans la matrice BME-R1 en 3D dans une plaque pré-préwargée en U de 96 puits.</li>
	<li>Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre la solidification de la matrice BME-R1.</li>
	<li>Ajouter 125 μL/puits de milieux ENR (facteur de croissance épidermique/Noggin/R-spondin1) préchauffés : milieu DMEM F-12 avancé, complété par 1x pénicilline : streptomycine, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5 % de milieu conditionné de cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acétyl cystéine et 0,05 mg/mL de primocine.</li>
	<li>Incuber les villosités plaquées dans un incubateur de culture tissulaire maintenu à 37 °C avec 5% de CO2et changer le milieu tous les deux jours.</li>
	<li>Jetez tout puits dans lequel des organoïdes apparaissent avant deux jours de placage, car le premier moment où les organoïdes dérivés des villosités sont attendus est après deux jours. REMARQUE: Tous les villosités qui ont la moitié ou plus de la moitié de la longueur des villosités sont comptées comme une villosité. Contrairement aux organoïdes dérivés de la crypte, les organoïdes dérivés des villosités ne sont pas attendus dans les 24 heures suivant le placage. Les villosités initiatrices des organoïdes semblent s’assombrir et rétrécir avant la formation d’organoïdes. Par conséquent, tous les puits avec des organoïdes se développant dans la journée de placage doivent être jetés pour éviter la plausibilité d’avoir dérivé d’une contamination plausible de la crypte. La méthodologie utilisée pour produire les supports conditionnés est disponible sur demande.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li>
<li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li>
<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
<li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
<li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li>
<li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc%28min%29+mice+downstream+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
<li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cette méthode peut confirmer la capacité d’auto-renouvellement de l’épithélium des villosités dédifférenciantes qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. L’épithélium intestinal normal peut donner naissance à des organoïdes de la crypte mais pas du compartiment des villosités, lorsqu’il est cultivé en 3D en raison de la présence de cellules souches dans les cryptes1. Ainsi, la formation d’organoïdes à partir de l’épithélium des villosités dédifférenciées cultivé dans des c...

Les cryptes intestinales, mais pas les villosités, forment des organoïdes lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice de Matrigel ou de BME-R1. Ces organoïdes sont des structures auto-organisatrices, souvent appelées « mini-intestin » en raison de la présence des différentes lignées différenciées, progéniteurs et cellules souches présents dans l’épithélium intestinal in vivo. Le potentiel de formation d’organoïdes à partir de cryptes est attribué à la présence de cellules souches1. Les villosités intestinales, d’autre part, ne sont constituées que de cellules différenciées et ne peuvent donc pas former d’organoïdes. Cependant, les mutations2 ou les conditions qui permettent la dédifférenciation de l’épithélium des villosités peuvent conduire à des cellules souches dans lesvillosités 2,3. Ce changement de destin entraînant une tige dans l’épithélium des villosités peut être confirmé en plaquant l’épithélium villositédifférenciant dans une matrice 3D afin de déterminer leur potentiel de formation d’organoïdes comme indicateur de la tige de novo dans l’épithélium villus. Par conséquent, l’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte.
La mutation conditionnelle Smad4KO:β-caténineGOF provoque une dédifférenciation dans l’épithélium intestinal marquée par l’expression de marqueurs de prolifération et de cellules souches dans les villosités, et finalement la formation de structures de type crypte dans les villosités appelées cryptes ectopiques La présence de cellules souches ces villosités dédifférenciées a été déterminée par l’expression de marqueurs de cellules souches dans les cryptes ectopiques(in vivo)et la capacité des villosités mutantes à former des organoïdes wh en plaqué Matrigel3. La procédure mentionnée ci-dessous élabore la méthodologie utilisée pour confirmer la tige de l’épithélium intestinal dédifférenciant chez les souris mutantes Smad4KO:β-caténineGOF. Une caractéristique clé de cette méthodologie pour isoler les villosités était l’utilisation du grattage de la lumière intestinale, par opposition à la méthode de chélation EDTA4. Contrairement à la méthode de chélation EDTA, l’isolement des villosités par grattage conserve la majorité du mésenchyme sous-jacent et permet d’ajuster la pression de grattage pour produire des villosités sans cryptes attachées. La pression de raclage est subjective pour l’opérateur, par conséquent, la pression optimale pour produire des villosités sans cryptes attachées doit être déterminée empiriquement par l’opérateur. L’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte par un examen microscopique des villosités avant et après le placage dans la matrice BME-R1.
Les villosités intestinales sont grattées de la lumière intestinale avec des lames de verre et placées dans un filtre de 70 μm et lavées avec du PBS pour se débarrasser des cellules lâches ou des cryptes, le cas échéant, avant le placage dans la matrice BME-R1. La méthode met l’accent sur les critères suivants pour éviter la contamination des tésiers : a) confiner la récolte des villosités dans la moitié proximale du duodénum où les villosités sont les plus longues, b) minimiser le nombre d’éraflures produisant des villosités, c) laver le filtre contenant les villosités à travers une série de PBS dans une boîte à six puits, et d) confirmer l’absence de contamination des cryptes par un examen microscopique avant et après le placage dans la matrice BME-R1. L’isolement de Villosité par grattage, plutôt que par chélation EDTA, empêche la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche5,6,7,8, si nécessaire, pour l’initiation organoïde de l’épithélium villus.

<table><tbody><tr><td>Média DMEM F-12 avancé</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidine</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond en U à 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>kit ABC</td><td>Vector Labs</td><td>&nbsp ; PK4001</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux coudés</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>Exempt d’animaux Recombinant humain EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément (50X), moins de vitamine A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) Poudre sans protéase</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD44</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>Anticorps 1030001</tr><tr><td>Cdx2</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>Huile de maïs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire Corning 70 microns</td><td>Sciences</td><td>de la vie 431751</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Extrait de membrane basale à facteur de croissance réduit, type</td><td>R1 R& D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HEK 293-T exprimant RSPO-1</td><td>Don du Dr Michael Verzi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à mailles</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Lame de verre Micrscope</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplément (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acétyl cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 Embouts émoussés</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (50mg/mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Diluant de signal</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

culture 3d d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

La clonogénicité des organoïdes de l’épithélium intestinal est attribuée à la présence de cellules souches dans celui-ci. L’épithélium de l’intestin grêle de la souris est compartimenté en cryptes et villosités : la tige et les cellules proliférantes sont confinées dans les cryptes, tandis que l’épithélium des villosités ne contient que des cellules différenciées. Par conséquent, les cryptes intestinales normales, mais pas les villosités, peuvent donner naissance à des organoïdes dans les cultures 3D. La procédure décrite ici ne s’applique qu’à l’épithélium des villosités subissant une dédifférenciation conduisant à la tige. La méthode décrite utilise la souris mutante conditionnelle Smad4-loss-of-function:β-caténine gain-of-function (Smad4KO:β-caténineGOF). La mutation provoque la dédifférenciation des villosités intestinales et la génération de cellules souches dans les villosités. Les villosités intestinales subissant une dédifférenciation sont grattées de l’intestin à l’aide de lames de verre, placées dans une passoire de 70 μm et lavées plusieurs fois pour filtrer les cellules lâches ou les cryptes avant le placage dans la matrice BME-R1 afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde. Deux critères principaux ont été utilisés pour s’assurer que les organoïdes résultants ont été développés à partir du compartiment des villosités dédifférenciantes et non à partir des cryptes: 1) évaluer au microscope les villosités isolées pour s’assurer de l’absence de cryptes attachées, avant et après le placage dans la matrice 3D, et 2) surveiller le déroulement du développement organoïde à partir des villosités. L’initiation organoïde à partir des villosités ne se produit que deux à cinq jours après le placage et semble de forme irrégulière, tandis que les organoïdes dérivés de la crypte du même épithélium intestinal sont apparents dans les seize heures suivant le placage et semblent sphériques. La limite de la méthode, cependant, est que le nombre d’organoïdes formés et le temps nécessaire à l’initiation organoïde à partir des villosités varient en fonction du degré de dédifférenciation. Par conséquent, en fonction de la spécificité de la mutation ou de l’insulte à l’origine de la dédifférenciation, le stade optimal auquel les villosités peuvent être prélevées pour déterminer leur potentiel de formation organoïde doit être déterminé empiriquement.

Le facteur déterminant pour le succès de la procédure est la prévention de la contamination des cryptes. Le développement organoïde à partir des villosités (et non à partir de cryptes contaminantes) est assuré par la confirmation de quatre critères majeurs: 1) assurer la pureté des villosités prélevées par un examen microscopique avant et après le placage des villosités dans BME-R1, 2) placage d’un nombre limité de villosités par puits pour permettre la visualisation de tous les villosités plaquées individuellement, 3) s...

La procédure décrit l’isolement des villosités de l’épithélium intestinal de la souris subissant une dédifférenciation afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde.

Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Cette méthode peut confirmer la capacité de formation d’organoïdes de dédéliférer l’épithélium des villosités qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. La collecte des villosités est effectuée par grattage plutôt que par la méthode de chélation EDTA empêchant la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche si nécessaire pour l’initiation organoïde. Cette méthode est applicable dans les tissus épithéliaux où les compartiments prolifératifs et différenciés sont physiquement délimités et où les cellules démilinciantes expriment des marqueurs de cellules souches in vivo.Certains facteurs de ce protocole doivent être déterminés empiriquement, y compris l’étape optimale pour la récolte des villosités et la pression optimale pour gratter les villosités, ce qui prendra du temps et de la pratique. Induire le knockout Smad4 et le gain de fonction de la bêta-caténine chez des souris mutantes avec injection intrapéritonéale de tamoxifène et d’huile de maïs pendant quatre jours consécutifs. Après avoir euthanasié la souris, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure de la souris de pénétrer dans la cavité péritonéale.Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux à dissection pour exposer l’intestin et isolez l’intestin à l’aide de ciseaux et de pinces. Disséquez la moitié proximale du duodénum, puis rincez le duodénum avec cinq millilitres de PBS glacé dans une seringue de 10 millilitres pour éliminer le contenu luminal. Ouvrez le duodénum longitudinalement avec un ciseau incliné et posez le duodénum à plat sur une boîte de Petri de 15 centimètres sur de la glace avec la lumière du duodénum face à l’opérateur.Avant de commencer le raclage, placez une passoire à mailles de 70 micromètres dans l’un des puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Remplissez tous les puits avec quatre millilitres de PBS 1X et placez la plaque sur de la glace. Grattez les villosités à l’aide de deux lames de verre microscopiques, l’une pour maintenir le duodénum vers le bas et l’autre pour gratter.Gratter le côté luminal du duodénum superficiellement deux fois pour enlever le mucus sans enlever les villosités, puis gratter le duodénum deux fois de plus pour recueillir les villosités sur les diapositives sans attacher les cryptes. Utilisez une pipette de transfert d’un millilitre contenant du PBS pour transférer les villosités vers une passoire maillée de 70 micromètres dans la parabole à six puits. Ramassez les villosités après chaque éraflure.Pour éliminer les cryptes lâches, lavez les villosités recueillies avec la passoire de 70 micromètres en transférant la passoire à travers une série de puits dans la boîte de six puits contenant quatre millilitres de PBS glacé par puits. À l’aide d’une pipette P1000, transférez la suspension de villosités dans environ trois millilitres de PBS de la crépine de 70 micromètres vers un nouveau tube de 15 millilitres sur glace. Utilisez une pointe de pipette P200 à 0,1 % revêtue de BSA pour transférer un volume de 50 microlitres de la suspension à villosités sur une glissière en verre.Comptez le nombre de villosités dans la gouttelette de 50 microlitres sous grossissement 4X pour déterminer la concentration de villosités dans la suspension PBS et pour confirmer l’absence de cryptes attachées. Pour plaquer les villosités, utilisez une pointe de pipette à extrémité émoussée P200 revêtue de 0,1 % de BSA pour transférer les villosités dans un tube de microcentrifugation pour une densité de placage de six villosités par puits dans 12,5 microlitres de matrice BME-R1. Faites tourner les villosités pendant deux minutes à 200 fois G à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant et répétez la centrifugation pour éliminer tout PBS résiduel. Dans une hotte à écoulement laminaire, remettez ensemisement doucement la pastille dans la quantité requise de BME-R1 froid décongelé sur de la glace. À l’aide d’une pipette P20, plaque 12,5 microlitres des villosités dans la matrice BME-R1 par puits d’une plaque à fond en U de 96 puits préchauffée à 37 degrés Celsius.Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la solidification de la matrice BME-R1. À chaque puits, ajoutez 125 microlitres de supports ENR préchauffés complétés comme décrit dans le manuscrit textuel. Incuber les villosités plaquées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et changer le milieu tous les deux jours.Jetez tout puits dans lequel les organoïdes apparaissent avant deux jours. Il y a une différence dans l’apparence des organoïdes émergeant des cryptes par rapport à l’épithélium des villosités déconiffé différencié du même intestin de souris. Les organoïdes dérivés de la crypte apparaissent du jour au lendemain comme des structures sphériques avec des bordures bien définies.La cinétique et l’aspect morphologique des organoïdes initiés à partir des villosités ont été examinés, qui semblent de forme irrégulière au début et prennent de deux à cinq jours avant de pouvoir être vus au microscope. L’initiation organoïde à partir de deux villosités différentes est montrée. Les villosités ayant un potentiel de formation organoïde semblent denses, peut-être en raison de la rétention du mésenchyme sous-jacent.L’initiation organoïde des villas est apparente au deuxième jour depuis l’un des villosités. Alors que dans les autres villas, l’organoïde apparaît au quatrième jour. Il est crucial de prendre les mesures appropriées pour éviter la contamination des cryptes lors du prélèvement des villosités et de la croissance des organoïdes qui en résultent.Des différences phénotypiques entre les organoïdes émergeant des cryptes et des villosités du même mutant ont été observées à la suite de cette procédure, de sorte que d’autres expériences ont pu être menées pour rechercher des différences moléculaires entre les deux. Ce protocole pourrait être utilisé pour étudier les différences entre les organoïdes issus des cryptes endogènes et les cryptes ectopiques résultant de la dédifférenciation, de sorte que les implications de la dédifférenciation pourraient être abordées.

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