Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

L’objectif global de cette technique de nettoyage est d’établir une méthode de nettoyage des tissus pour le cerveau du rat. Ce protocole peut également être utilisé pour le rat transgénique VIH-1. Le principal avantage de cette technique est que le tissu cérébral du rat peut être laissé intact pour être nettoyé, ce qui permet une analyse complète au niveau du circuit.

Kristin Kirchner, une candidate au doctorat de mon laboratoire, ainsi que Hailong Li, un associé de recherche de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir effectué une perfusion transcardique chez un rat âgé de trois à six semaines, retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une pince. Ensuite, placez-le en position sagittale et coupez-le en quatre sections égales de trois millimètres de large à l’aide d’une lame de rasoir et d’une matrice de cerveau de rat.

Fixez chaque section à quatre pour cent de PFA dans un tube en plastique scellé de cinq millilitres pendant la nuit sur un agitateur à quatre degrés Celsius. Le lendemain, continuez la fixation à température ambiante pendant une heure. Lavez chaque section trois fois avec du PBS pendant environ 30 minutes par lavage.

Incuber en série les sections lavées dans une solution à 20, 40, 60, 80 et 100 % de méthanol pendant une heure chacune. Répétez la déshydratation avec du méthanol à 100 %. Ensuite, refroidissez les échantillons dans du méthanol à 100 % à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Préparez une solution contenant 66 % de DCM et 33 % de méthanol et incubez les sections réfrigérées dans cette solution pendant la nuit à température ambiante en agitant. Le lendemain, lavez l’échantillon deux fois avec du méthanol pendant 30 minutes et refroidissez-le dans du méthanol à 100 % à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour le blanchiment, placez l’échantillon dans du peroxyde d’hydrogène frais à cinq pour cent dans du méthanol et incubez-le pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation d’une nuit, incuber l’échantillon en série dans des solutions de méthanol à 80, 60, 40 et 20 % pendant une heure chacune à température ambiante. Ensuite, incubez l’échantillon dans du PBS pendant une heure et lavez-le deux fois en solution une fois pendant une heure par lavage. Remplissez une seringue d’un millilitre avec 2,5 microlitres de biotine-CTB à un pour cent et injectez-la lentement dans le site du noyau accumbens pendant 20 secondes.

Laissez la pointe de l’aiguille en place pendant une minute et retirez-la lentement pendant 10 secondes pour éviter les fuites. Incuber l’échantillon dans la solution trois, puis dans la solution quatre pendant deux jours chacun dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite l’anticorps primaire et poursuivez l’incubation pendant sept jours.

Lavez l’échantillon cinq fois dans la solution deux pendant une heure par lavage et conservez-le dans la solution deux à température ambiante pendant la nuit. Incuber l’échantillon avec un anticorps secondaire pendant sept jours dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Enfin, lavez-le cinq fois dans la solution deux pendant une heure par lavage et conservez-le dans la solution deux à température ambiante pendant la nuit dans une faible luminosité.

Incuber l’échantillon en série dans du méthanol à 20, 40, 60, 80 et 100 % pendant une heure chacun à température ambiante. Ensuite, incubez-le dans du 100 % méthanol frais pendant la nuit. Le lendemain, incubez l’échantillon dans du DCM à 66 % dans du méthanol à 33 % fraîchement préparé pendant trois heures à température ambiante en agitant.

Après trois heures, incubez l’échantillon dans de l’éther dibenzylique sans agiter jusqu’à ce qu’il soit clair. Ensuite, stockez-le dans de l’éther dibenzylique jusqu’à l’imagerie. Procurez-vous une chambre d’imprimante 3D et fixez-la à une lame de microscope à l’aide d’époxy.

Placez l’échantillon dans l’espace carré au milieu de la chambre et remplissez complètement la chambre d’éther dibenzylique. Placez une lamelle de 0,17 millimètre d’épaisseur sur la chambre et appliquez une pression pour vous assurer qu’elle est en plein contact avec les parois de la chambre. Scellez ensuite les bords à l’aide d’époxy.

Assurez-vous de faire pivoter la chambre pour permettre aux bulles d’air de s’échapper de l’entrée de remplissage. Remplissez la chambre avec de l’éther dibenzylique supplémentaire. Scellez ensuite l’entrée de remplissage avec de l’époxy et laissez-le durcir.

Observez l’échantillon à l’aide d’un système de microscope confocal pour effectuer un z-scan à un grossissement de quatre fois. L’image confocale d’un échantillon de tissu éliminé hydrophobe à un grossissement de quatre fois montre une coloration dense de la TH dans la zone de la substance nigra, des neurones TH clairsemés adjacents à la substance mineure et une zone noire foncée de tissu dépourvue de neurones TH. La morphologie typique d’un neurone TH-positif à un grossissement de 20 fois a un grand soma et plusieurs processus de ramification.

Alors que les microglies colorées par IBA1 ont de petits corps cellulaires et des processus d’extension plus courts. L’image confocale idéale montre une coloration TH positive et dense dans la zone de la substance noire avec un gain de fluorescence approprié. Des exemples d’images confocales médiocres comprennent une image mal focalisée avec un gain fluorescent trop important, une coloration faussement positive avec des points lumineux qui ne sont pas nets avec le reste du tissu et une coloration de fond élevée résultant de l’utilisation d’un sérum bloquant qui ne correspond pas à un anticorps secondaire.

Une coloration CTB positive dans le cerveau du rat est illustrée ici. Les longues fibres minces sont des projections afférentes le long de la voie dopaminergique. La colocalisation de TH et CTB permet de visualiser le site d’injection dans la zone du noyau accumbens qui apparaît sous la forme d’un cercle vert densément fluorescent.

La colocalisation de TH et CTB dans la substance noire est illustrée ici. Les choses les plus importantes à retenir lors de cette procédure sont de laisser à l’échantillon suffisamment de temps pour incuber dans toutes les solutions d’anticorps et suffisamment de temps pour disparaître complètement avant l’imagerie. L’échantillon doit être exposé à l’air limité car cela endommagerait l’échantillon.

Cette technique est très polyvalente et peut être utilisée pour étudier de nombreuses protéines d’intérêt différentes dans différentes régions du cerveau. La technique actuelle aide les neuroscientifiques à étudier le cerveau du rat au niveau du circuit, ce qui est essentiel pour l’étude du cerveau dans son ensemble.