Name: Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Apprenez la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour analyser la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette technique non invasive offre une excellente résolution spatiale et temporelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SB, SM et DM ont été soutenus par des financements institutionnels du CNRS, de l’Inserm et de l’Université Aix-Marseille et des subventions de programmes de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-17-CE15-0032-01 et ANR-18-CE15-0021-02) et de l’Français « Investissement d’Avenir » (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW reconnaît « BioTechNan », un programme d’études doctorales environnementales interdisciplinaires KNOW dans le domaine de la biotechnologie et de la nanotechnologie. EB reconnaît le soutien financier du Centre national des sciences de Pologne (NCN) dans le cadre du projet n° 2016/21/D/NZ1/00285, ainsi que du gouvernement Français et de l’ambassade de France en Pologne. MŁ reconnaît le soutien financier du ministère polonais du Développement (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) et du Centre national de recherche et de développement (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT reconnaît le soutien financier du Centre national des sciences de Pologne (NCN) dans le cadre du projet n° 2016/21/B/NZ3/00343 et du Centre de biotechnologie de Wroclaw (KNOW).

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
<li>Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ABC+kinases+by+phosphorylation%3A+protein+kinase+C+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm.</a> The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: From model membranes to cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+as+a+membrane-organizing+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts as a membrane-organizing principle.</a> Science. , (2010).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+cell+membrane%3A+Do+proteins+rule+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).</li>
<li>Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluid+-+Mosaic+Model+of+Membrane+Structure%3A+Still+relevant+to+understanding+the+structure%2C+function+and+dynamics+of+biological+membranes+after+more+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).</li>
<li>Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+undergo+hop+diffusion+in+compartmentalized+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shift+of+the+plasma+membrane+concept+from+the+two-dimensional+continuum+fluid+to+the+partitioned+fluid%3A+high-speed+single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).</li>
<li>Destainville, N., Salomé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).</li>
<li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Un%29confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. , (1976).</li>
<li>Petrášek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2008).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((40+Years+of+FCS%3A+How+it+all+began%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">40 Years of FCS: How it all began.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Elson, E. L., Magde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+I.+Conceptual+basis+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+II.+An+experimental+realization%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+in+living+cells+observed+by+fluorescence+correlation+spectroscopy+with+one-+and+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation.</a> Biophysical Journal. , (1999).</li>
<li>Bouchaud, J. P., Georges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffusion+in+disordered+media%3A+Statistical+mechanisms%2C+models+and+physical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Reports%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications.</a> Physics Reports. , (1990).</li>
<li>Yechiel, E., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-scale+domains+in+fibroblast+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes.</a> Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).</li>
<li>Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+domains+by+FRAP+experiments+at+variable+observation+areas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas.</a> European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).</li>
<li>Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+K-Ras+and+H-Ras+display+different+interactions+with+saturable+nonraft+sites+at+the+surface+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+diffusion+laws+to+probe+the+submicron+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+corralation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence corralation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Lenne, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+confinement+in+the+plasma+membrane+by+microdomains+and+the+cytoskeleton+meshwork%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork.</a> EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).</li>
<li>Ruprecht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contractility+triggers+a+stochastic+switch+to+fast+amoeboid+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Billaudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+plasma+membrane+organization+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).</li>
<li>Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+for+characterizing+plasma+membrane+subdomains+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).</li>
<li>Rege, T. A., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%2C+a+versatile+modulator+of+signaling+affecting+cellular+adhesion%2C+proliferation%2C+survival%2C+and+cytokine%2Fgrowth+factor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).</li>
<li>Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCahuzac%2C+N+%22Blood%22">Blood</a>. , (2006).</li>
<li>Guia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+of+activating+receptors+at+the+plasma+membrane+controls+natural+killer+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance.</a> Science Signaling. 4 (167), 21(2011).</li>
<li>Blouin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation-dependent+IFN-%CE%B3R+partitioning+in+lipid+and+actin+nanodomains+is+critical+for+JAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation.</a> Cell. 166 (4), 920-934 (2016).</li>
<li>Chouaki-Benmansour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+regulate+the+TCR%2FCD3+complex+membrane+dynamics+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation.</a> Scientific Reports. , (2018).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+to+determine+diffusion+laws%3A+application+to+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Micro-+and+Nano-Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes.</a> Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).</li>
<li>Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescence+correlation+spectroscopy+enabling+direct+observation+of+spatiotemporal+dependence+of+diffusion+constants+as+an+evidence+of+anomalous+transport+in+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Humpolíčková, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2006).</li>
<li>Benda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+diffusion+coefficients+in+planar+phospholipid+systems+by+confocal+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy.</a> Langmuir. , (2003).</li>
<li>Ganguly, S., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+mimics+the+effect+of+cytoskeletal+destabilization+on+membrane+dynamics+of+the+serotonin1A+receptor%3A+A+zFCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li>
<li>Wenger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+analysis+within+single+nanometric+apertures+reveals+the+ultrafine+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).</li>
<li>Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+intact+living+cell+membranes+with+NSOM+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes.</a> Biophysical Journal. , (2011).</li>
<li>Regmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+optical+nanoantennas+resolve+cholesterol-dependent+nanoscale+heterogeneities+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells.</a> Nano Letters. , (2017).</li>
<li>Mueller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+in+STED+microscopy%3A+Studying+the+nanoscale+of+lipid+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nanoscale+diffusion+dynamics+in+cellular+membranes+with+super-resolution+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+STED-background+corrected+fitting+model+for+unbiased+STED-FCS+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Veerapathiran, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+imaging+FCS+diffusion+law+in+the+presence+of+multiple+diffusive+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+hop+or+not+to+hop%3A+exceptions+in+the+FCS+diffusion+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law.</a> Biophysical Journal. , (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit la mise en œuvre du module svFCS sur un microscope fluorescent standard, une approche expérimentale puissante pour déchiffrer la dynamique de l’organisation de la membrane plasmique dans les cellules vivantes grâce à l’analyse de la loi de diffusion FCS. Conceptuellement, le svFCS repose sur un principe simple : des mesures de corrélation de fluorescence dans le domaine temporel tout en faisant varier la taille de la zone d’éclairage23. Cette stratégie a joué un rôle déterminant dans la déduction d’informations nanoscopiques à partir de mesures microscopiques, ce qui aide à déchiffrer les principaux éléments physico-chimiques contribuant à l’organisation de la membrane plasmique à l’état d’équilibre25 et aux processus physiologiques 30,31,32,33. Dans l’ensemble, ces analyses svFCS démontrent sans ambiguïté l’existence de nanodomaines lipidiques dans divers types de cellules et leur implication directe dans le réglage de différents événements de signalisation.
Dans ce cadre, certains aspects optiques doivent être pris en compte lors de la construction de la configuration svFCS afin d’optimiser le budget de photons et de minimiser les aberrations optiques. Ainsi, nous vous recommandons d’utiliser un microscope à partir duquel la lentille tubulaire peut être retirée lorsque la mesure svFCS est effectuée. De plus, un seul iris joue un rôle clé dans la configuration svFCS : il modifie la taille du faisceau à l’ouverture arrière de l’objectif, faisant ainsi varier directement le tour de taille effectif (c’est-à-dire le volume d’excitation effectif). Le diamètre de la poutre doit s’adapter à la pupille arrière de l’objectif pour obtenir le plus petit tour de taille34. Cette option, qui permet d’ajuster le tour de taille, assure l’optimisation du budget photon et est facile à mettre en œuvre. Enfin, un nombre minimal de pièces optiques sont utilisées le long du trajet de la lumière; moins le système est complexe, moins il y a de photons perdus. Toutes ces options améliorent considérablement la robustesse des expériences svFCS.
En ce qui concerne le protocole lui-même, quelques étapes critiques doivent être prises en compte. Le plus important est un alignement approprié des chemins optiques qui est crucial pour des mesures svFCS réussies (protocole, section 2). Ceci est facile à vérifier en analysant le signal de fluorescence d’une solution Rh6G de 2 nM, qui devrait être d’environ 200 kHz sous un éclairage laser de 300 μW. Tous les iris doivent être ouverts et les ACF doivent avoir une amplitude importante (généralement G0 ~ 1,5-2,0). Un autre point critique concerne les cellules et leur préparation pour l’analyse svFCS (protocole, sections 4-8). Leur densité doit être adaptée afin que les cellules isolées à observer soient disponibles pour analyse. Les cellules non adhérentes doivent être immobilisées sur un verre de couverture chambré en utilisant une solution de poly-L-lysine. Le signal de fluorescence de l’étiquetage des cellules ne doit pas être trop fort, sinon il en résultera des ACF très plats difficiles à ajuster, et les paramètres d’ajustement sont chargés d’une erreur importante. De plus, le marquage non homogène et les agrégats de fluorescence dans les cellules rendent les mesures svFCS extrêmement difficiles à interpréter. Enfin, le traitement par cholestérol oxydase affecte la viabilité cellulaire et l’analyse svFCS ne doit pas dépasser une heure après le traitement. Il est également préférable d’enregistrer les fluctuations de fluorescence de la membrane plasmique supérieure car elle n’est pas attachée au support et il n’y a aucun risque d’entrave à la diffusion des molécules en raison des interactions physiques avec le support.
Il y a eu suffisamment de progrès dans la technique svFCS pour son utilisation dans différentes approches en raison de la diversité des modalités d’ajustement du volume de détection, ce qui permet d’étudier divers processus biologiques dans les cellules vivantes. Une alternative au réglage de la taille du volume d’excitation consiste à utiliser un expanseur de faisceau variable35. Il est également possible de moduler simplement la taille de la zone d’éclairage en enregistrant le signal fluorescent de l’interception de la membrane plasmique le long de la direction z36. Cela peut être fait sur un microscope confocal standard pour lequel un cadre théorique a été développé pour dériver la loi de diffusion37,38.
Bien que la méthode svFCS offre une résolution spatio-temporelle, nécessaire à la caractérisation de l’organisation latérale inhomogène de la membrane plasmique, les modes géométriques de confinement ne s’excluent pas mutuellement. Un écart de t0 dans un sens ou dans l’autre révèle exclusivement un mode dominant de confinement25. De plus, une autre limitation importante de la méthode svFCS actuelle résulte de la limite de diffraction optique classique (~200 nm). Ceci est incontestablement plus grand que les domaines confinant les molécules dans la membrane plasmique cellulaire. Par conséquent, l’analyse du confinement est déduite de la valeur t0 , extrapolée à partir de la loi de diffusion.
Cet inconvénient a été surmonté par la mise en œuvre de méthodes alternatives. Initialement, l’utilisation de films métalliques percés de nanoapertures offrait la possibilité d’éclairer une très petite surface membranaire (c’est-à-dire en dessous de la limite de diffraction optique des ouvertures nanométriques uniques de rayons variant entre 75 et 250 nm)39. Le régime de transition prédit à partir de la loi de diffusion théorique pour l’organisation de domaines isolés a ainsi été rapporté, et il a permis d’affiner la taille caractéristique des hétérogénéités de la membrane nanométrique et une estimation quantitative de la surface occupée par les nanodomaines dépendants des lipides39. Alternativement, l’éclairage nanométrique a également été développé en utilisant la microscopie optique à balayage en champ proche40 ou les nanoantennes optiques planaires41. Plus récemment, la combinaison de l’épuisement stimulé des émissions (STED) et du FCS a fourni un outil puissant et sensible pour documenter la loi de diffusion avec une très haute résolution spatiale. Ce STED-FCS donne accès à des caractéristiques de diffusion moléculaire à l’échelle nanométrique se produisant dans un court laps de temps, permettant l’étude de l’organisation dynamique des sondes lipidiques au niveau de la membrane plasmique 42,43. Cependant, la suppression incomplète de la fluorescence dans le processus STED remet en question l’analyse des courbes d’auto-corrélation dans FCS.
Un nouveau modèle d’ajustement a été développé pour surmonter cette difficulté, en améliorant la précision des temps de diffusion et des mesures moyennes du nombre de molécules44. Enfin, pour une diffusion moléculaire lente au niveau de la membrane plasmique, le principe svFCS peut être appliqué aux données enregistrées par spectroscopie de corrélation d’images45. Récemment, il a été démontré que la combinaison de la microscopie à force atomique (AFM) avec l’imagerie par réflexion interne totale FCS (ITIR-FCS) contribue à affiner la nature du mécanisme entravant la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique, en particulier près de la configuration de la membrane seuil de percolation en raison d’une densité élevée de nanodomaines46.
En conclusion, l’établissement de la loi de diffusion par svFCS a fourni les preuves expérimentales permettant de déduire l’hétérogénéité locale créée par les lipides collectifs dynamiques et les associations de protéines membranaires. Comme l’ont déclaré Wohland et ses collègues46, « l’analyse de la loi de diffusion FCS reste un outil précieux pour déduire des caractéristiques structurelles et organisationnelles inférieures à la limite de résolution à partir d’informations dynamiques ». Néanmoins, nous devons développer de nouveaux modèles pour affiner l’interprétation de la loi de diffusion qui devrait permettre une meilleure compréhension de la dynamique des événements moléculaires se produisant au niveau de la membrane plasmique.

La complexité de l’organisation des membranes plasmiques La compréhension actuelle de l’organisation de la membrane cellulaire doit prendre en compte plusieurs aspects1. Tout d’abord, une composition lipidique complexe varie non seulement entre les types de cellules, mais aussi au sein d’une seule cellule (organites membranaires/membrane plasmique). En outre, les protéines membranaires associées ou intrinsèques sont principalement organisées en complexes multimériques dynamiques, avec de grands domaines s’étendant à l’extérieur de la membrane, ce qui représente une surface significativement plus grande que celle des domaines transmembranaires seuls. De plus, les protéines associées à la membrane présentent des capacités spécifiques de liaison aux lipides ou d’interaction entre les lipides qui jouent un rôle dans la régulation de la fonction des protéines. Ceux-ci dépendent directement de la composition locale et de l’accessibilité des lipides2.
Enfin, un niveau significatif d’asymétrie est observé entre deux feuillets membranaires en raison de la structure asymétrique intrinsèque des protéines membranaires et de la distribution des lipides. En effet, un équilibre métabolique lipidique entre synthèse et hydrolyse, combiné à une bascule lipidique entre les folioles, génère une telle distribution asymétrique. Comme tout transport à travers la bicouche est limité par l’énergie libre nécessaire pour déplacer le groupe de tête polaire à travers l’intérieur hydrophobe des membranes, il est généralement assisté par des transporteurs sélectifs. Pour chaque type de cellule, l’asymétrie a tendance à être fermement maintenue. Ensemble, ces facteurs contribuent à l’inhomogénéité latérale ou à la compartimentation de la membraneplasmique 3,4.
Nous enrichissons cette représentation de la membrane plasmique en prenant en compte la diffusion moléculaire intrinsèque à l’intérieur et à travers la bicouche, qui contribue à l’hétérogénéité latérale dynamique sur une échelle de dixièmes à des centaines de nanomètres et de microsecondes à secondes. Par exemple, les nanodomaines membranaires dépendants des lipides – les radeaux lipidiques, définis comme du cholestérol, et les plates-formes de signalisation riches en sphingolipides – contribuent au compartimentation de la membrane plasmique 5,6. Cependant, la vision actuelle de l’organisation membranaire ne se limite pas aux seuls radeaux lipidiques. Les nanodomaines membranaires sont plus complexes et hétérogènes dans leur composition, leur origine et leur fonction. Néanmoins, leur présence au niveau de la membrane plasmique doit être étroitement coordonnée, et les interactions dynamiques entre les protéines et les lipides semblent être importantes dans la distribution spatiale et la modification chimique des nanodomaines membranaires 1,3,7,8.
Le principe svFCS et son application pour sonder l’organisation de la membrane plasmique Bien que de nombreux progrès aient été réalisés dans l’analyse des domaines membranaires, principalement grâce à des techniques biophysiques, les déterminants qui dictent l’organisation locale de la membrane plasmique doivent être affinés avec une résolution spatiale et temporelle appropriée. Les déterminants basés sur le suivi de molécules individuelles offrent une excellente précision spatiale et permettent la caractérisation de différents modes de mouvement 9,10,11,12, mais ont une résolution temporelle limitée avec de faibles fréquences d’images classiques et nécessitent plus d’efforts expérimentaux pour enregistrer un nombre important de trajectoires. Alternativement, le coefficient de diffusion des composants membranaires peut être évalué par récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)13 ou spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)14. Ce dernier a reçu plus d’attention, principalement en raison de sa sensibilité et de sa sélectivité élevées, de son volume de détection microscopique, de son faible caractère invasif et de sa large plage dynamique15.
La base conceptuelle de FCS a été introduite par Magde et ses collègues il y a environ 50 ans16,17. Il est basé sur l’enregistrement de la fluctuation de l’émission de fluorescence avec une résolution temporelle élevée (de μs à s)18. Dans sa version moderne, les mesures dans les cellules vivantes sont effectuées par un petit volume d’excitation confocale (~ 0,3 femtolitres) positionné dans une région d’intérêt (par exemple, au niveau de la membrane plasmique); le signal de fluorescence généré par la diffusion de molécules fluorescentes entrant et sortant du volume d’observation est recueilli avec une très haute résolution temporelle (c’est-à-dire l’heure d’arrivée de chaque photon sur le détecteur). Ensuite, le signal est calculé pour générer la fonction d’autocorrélation (ACF), à partir de laquelle est extrait le temps moyen t d (temps de diffusion) pour lequel une molécule reste dans le volume focal, ainsi que le nombre moyen de particules (N), présentes dans le volumed’observation, qui est inversement proportionnel à l’amplitude de l’ACF. Ce dernier paramètre pourrait être une information utile sur la concentration de la molécule dans le volume d’observation.
Depuis lors, un nombre croissant de modalités FCS ont été mises en œuvre grâce au développement rapide de l’instrumentation en biophotonique, permettant la description des phénomènes dynamiques se produisant dans les systèmes vivants. Néanmoins, une espèce moléculaire connaîtrait une distribution plus chevauchante des valeurs du coefficient de diffusion, ce qui se traduit généralement par une caractéristique de diffusion anormale, dans laquelle les molécules diffusent avec une relation non linéaire dans le temps19, et la difficulté d’identifier la signification biologique de cette sous-diffusion anormale. Dans le passé, cette difficulté a été quelque peu surmontée en enregistrant la diffusion moléculaire par FRAP à partir de zones de différentes tailles, plutôt que d’une seule zone, fournissant ainsi des informations spatiales supplémentaires. Cela a permis, par exemple, la conceptualisation de microdomainesmembranaires 20,21,22.
Une traduction de cette stratégie aux mesures FCS (c’est-à-dire la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle (svFCS)) a été établie en faisant varier la taille du volume focal d’observation, ce qui a permis d’enregistrer la fluctuation de la fluorescence à différentes échelles spatiales23. Ainsi, l’approche svFCS fournit des informations spatiales indirectes permettant l’identification et la détermination des modes de diffusion moléculaire et du type de partitionnement membranaire (domaines isolés versus contigus24) des molécules étudiées. En traçant le tempsde diffusion t d en fonction des différentes échelles spatiales définies par la valeur de la taille (ω), qui correspond à la taille du rayon du faisceau de détection dans ce cas23,25, on peut caractériser la loi de diffusion d’une molécule donnée dans un état physiologique donné. Le svFCS est donc un analogue parfait au suivi d’une seule particule dans le domaine temporel26. Sous la contrainte de diffusion brownienne, il faut s’attendre à une relation strictement linéaire entre le temps de diffusion td et la taille ω (Figure 1)23,25. L’origine de la déviation de la loi de diffusion par rapport à ce schéma peut être attribuée à des raisons non exclusives, telles que le maillage du cytosquelette, l’encombrement moléculaire, le partitionnement dynamique dans les nanodomaines, ou toute combinaison de ces effets et d’autres (Figure 1), et doit être testée expérimentalement25.
Ici, nous fournissons tous les points de contrôle nécessaires pour l’utilisation quotidienne d’un système optique svFCS sur mesure construit à partir de zéro, qui complète nos examens de protocole précédents27,28 sur cette approche expérimentale. En outre, comme preuve de concept, nous donnons des directives concernant l’étalonnage de la configuration, la préparation des cellules, l’acquisition de données et l’analyse pour l’établissement de la loi de diffusion svFCS (DL) pour Thy1-GFP, une protéine ancrée dans le glycosylphosphatidylinositol de la membrane plasmique, qui est connue pour être localisée dans les nanodomaines de radeau lipidique29. Enfin, nous démontrons comment la déstabilisation partielle des nanodomaines du radeau lipidique par le traitement à la cholestérol oxydase affecte les propriétés de diffusion de Thy1-GFP. En outre, une description détaillée de la construction d’une configuration svFCS à partir de zéro est fournie dans Matériel supplémentaire.

<table><tbody><tr><td>Clé à molette</td><td>pour bagues de retenue filetées SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>Photodiode d’avalanche et module de comptage de photons uniques (SPCM)</td><td>Module de comptage de photons uniques, photodiode d’avalanche</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 &Omega ; connecteur à 50 &Omega ; câble de prise 2 m</td><td>RS Components</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>Câble coaxial 415 connecteurs Cinch, RG-316, 50 &Omega ; Avec connecteur, 1,22 m, RoHS2</td><td>RS Components</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&Omega ; Adaptateur RF BNC Fiche vers BNC Socket 0 &rarr ; 1GHz</td><td>RS Components</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2,5 m, 8 prises Type E &ndash ; Rallonge française, 230 V</td><td>RS Components</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Mascot, 6W Plug In Alimentation 5V DC, 1.2A, 1 sortie Alimentation à découpage, Type C</td><td>RS Components</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 Câble d’alimentation de l’oscillateur de référence Adaptateur RF</td><td>RS Components</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Filtrage de fluorescence</td><td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&deg ; Chrominance Diamètre 25 mm</td><td>AHF</td><td>filtre F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Séparateur de faisceau laser zt488 RDC, AOI 45&deg ; Chroma 25,5 x 36 x 1 mm</td><td>Filtre AHF</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Filtre passe-long, AOI 0&deg ; Chroma Diamètre 25</td><td>Filtre AHF</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Corrélateur matériel Corrélateur numérique</td><td>80 MHz Correlator.com</td><td></td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Laser</td><td>LASER LASOS LDM-XT couplé à la fibre, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Sécurité laser</td><td>Ruban de masquage noir haute performance, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Rouleau</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>Mouchoirs d’objectif, 25 feuilles par livret, 5 livrets</td> Lunettes de sécurité laser <td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>, verres orange clair, transmission de la lumière visible à 48 %</td> Microscope <td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>à fluorescence inversée motorisé Zeiss Axiovert 200M Mise au point fine et grossière, rotation de la tourelle réflecteur, rotation de la tourelle porte-objectifs de l’objectif, commutation des ports de caméra et obturateurs à lumière interne</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected pour FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm à D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adaptateur W0.8 / M27x0.75 H « 5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Bague centrale W0.8 - W0.8 H « 5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Chemin optique</td><td>D25.4mm Miroir, Argent protégé</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=60.0.mm, Achromat visible</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=35.0.mm, Achromat visible</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &micro ; sténopé monté en m</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm Monté Zéro, Commande 1/2 Waveplate 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Platine de rotation 56 mm x 26 mm Fileté ID</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Plate-forme cinématique Montage</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Pince à prisme réglable</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Bloc de faisceau - zone active 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>Diaphragme à iris Ouverture de 1 mm à 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Monture d’objectif cylindrique cinématique pour gaucher</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>support optique 1", prise M4</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>Tube d’objectif empilable 1 »</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>Monture d’objectif empilable pour une profondeur optiquement utilisable de 1 » &frac12 ;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>Monture d’objectif empilable pour 1 » Profondeur optique utilisable 2"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Petit Rail Optique 600mm, métrique</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600/M</td></tr><tr><td></td><td>Petit Rail Optique 75mm, métrique</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075/M</td></tr><tr><td></td><td>Petit Rail Optique 150mm, métrique</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Trou contre-alésé 1"x 1"</td><td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, queue d’aronde perpendiculaire</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>Monture d’objectif de translation de haute précision pour 1 pouce</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&frac12 ; " (12mm) Platine de translation en queue d’aronde</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Clamps</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>Platine de translation métrique XYZ (y compris PT102)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>Tissu caoutchouté noir</td><td>Thorlabs</td> Kit de tournevis à billes <td>BK5</td></tr><tr><td></td>/ <td>6 outils</td><td>Adaptateur Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>avec filetages externes M6 x 1.0 et filetages externes M4 x 0.7</td> Base de montage <td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td>, <td>25 mm x 58 mm x 10 mm, paquet de 5</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Monture d’objectif pour optique 25,4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 Adaptateur FC/APC</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>Monture de miroir cinématique pour optique 1 pouce</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>Tête d’alimentation en silicium, 400-1100nm, 50mW</td><td>Supports de poteau Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm, vis à oreilles à verrouillage hexagonal à ressort, L=50 mm, paquet de 5</td><td>Thorlabs</td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Support de poteau avec vis à oreilles à verrouillage hexagonal à ressort, L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 50 mm Poteau optique en acier inoxydable, M4 Goujon, M6-Taud, Paquet de 5</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Poteau optique en acier inoxydable 12,7 mm x 75 mm, M4 Goujon, M6-Taud, Paquet de 5</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Interface USB pour compteurs d’énergie et d’énergie</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>Poteau optique en acier inoxydable de 12,7 mm x 30 mm, goujon M4, trou taraudé M6</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 20 mm Poteau optique en acier inoxydable, goujon M4, trou taraudé</td><td>M6 Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail structurel de 750 mm de long (boîtier de détection)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail structurel de 350 mm de long (boîte de détection)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>Quick Corner Cube pour rails de 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>Support à angle droit pour rails de 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>Panneau d’affichage noir 20 » x 30 » (508 mm x 762 mm), 1/16 » (1,6 mm) d’épaisseur, 5 feuilles</td><td>Charnière Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>pour boîtiers de rail de</td> <td>25 mmThorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>Butée de couvercle pour boîtiers de rail de 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 Kit de vis d’assemblage</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 Kit de vis d’assemblage et kit de quincaillerie</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>Pince de table, forme en L, paquet de 5</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 Diaphragme à iris actionné par anneau (&Oslash ; 0,8 - et Oslash ; 12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash ; Disque d’alignement en verre dépoli monté sur SM1 de 1 po avec Oslash ; Trou de 1 mm</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>Plateau de table optique en nid d’abeille, Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>Support de table optique, Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>Nano-positionnement d’échantillon</td><td>Précision XYZ</td><td>Nanopositionnement Physik Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>Piezo Co numérique multicanaux, 3 canaux, -30 à 130 V Connecteur(s) Sub-D, Capteurs capacitifs,</td> <td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>Chambre de température</td><td>Zeiss 200M Système d’incubation de microscope inversé MATT BLK</td> Digital <td>Pixel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Contrôleur de température à microprocesseur à double canal Pixel</td><td>numérique</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>deux modules</td> <td>de chauffage sans vibrationCapteur de température Digital Pixel</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100 Digital</td><td>Pixel</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>Réactifs et matériaux biologiques</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Culture cellulaire et transfection</td><td>de cellules Cos7</td><td>ATCC&reg ;</td><td>CRL-1651&commerce ;</td></tr><tr><td></td><td>Chambres Lab-Tek à 8 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>tampon PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet Réactif de transfection</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>Mesure de la teneur en cholestérol</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Inhibiteur de phosphatase Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant Working Solution</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover Lecteur de microplaques</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS mesures</td><td>HBSS tampon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>Hepes tampon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>Cholestérol oxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Les processus biologiques dynamiques dans les cellules vivantes, y compris ceux associés à l’organisation de la membrane plasmique, se produisent à diverses échelles spatiales et temporelles, allant du nanomètre au micromètre et de la microseconde à la minute, respectivement. Un tel éventail de processus biologiques remet en question les approches de microscopie conventionnelles. Ici, nous détaillons la procédure de mise en œuvre des mesures de spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle (svFCS) à l’aide d’un microscope à fluorescence classique qui a été personnalisé. Le protocole comprend un contrôle de performance spécifique de la configuration svFCS et les directives pour les mesures de diffusion moléculaire par svFCS sur la membrane plasmique des cellules vivantes dans des conditions physiologiques. De plus, nous fournissons une procédure pour perturber les nanodomaines du radeau de membrane plasmique par le traitement par le cholestérol oxydase et démontrons comment ces changements dans l’organisation latérale de la membrane plasmique pourraient être révélés par l’analyse svFCS. En conclusion, cette méthode basée sur la fluorescence peut fournir des détails sans précédent sur l’organisation latérale de la membrane plasmique avec la résolution spatiale et temporelle appropriée.

Nous avons généré un DL pour Thy1-GFP exprimé en cellules Cos-7 (Figure 4, carrés noirs). La loi de diffusion a une valeur t0 positive (19,47 ms ± 2 ms), indiquant que Thy1-GFP est confiné dans des structures de nanodomaine de la membrane plasmique. Le traitement par cholestérol oxydase des cellules exprimant Thy1-GFP a entraîné le déplacement de la valeur DL t0 à 7,36 ± 1,34 ms (Figure 4, carrés gris). Cette observation confirme que la nature du confinement de Thy1-GFP dépend de la teneur en cholestérol et est associée à des nanodomaines de radeau lipidique. Ces deux lois de diffusion se révèlent différentes selon le test statistique décrit ci-dessus (voir étape 9.1.3) en termes de valeurs t0 et Deff . De plus, nous avons évalué la concentration de cholestérol cellulaire total dans les cellules Cos-7 non traitées par rapport aux cellules traitées par COase. Une diminution faible, mais significative, de la teneur en cholestérol total est observée lors du traitement par COase (Figure 5). Comme cette enzyme n’agit que sur le pool de cholestérol accessible à la feuillet externe de la membrane plasmique, nous supposons que la diminution observée du cholestérol n’est associée qu’à la membrane plasmique et entraîne la déstabilisation des nanodomaines du radeau lipidique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Figure 1 : Lois de diffusion de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) simulées établies par FCS à variation ponctuelle pour différentes formes d’organisation membranaire. (Panneaux supérieurs) Représentation schématique de l’organisation membranaire ( A) diffusion libre, (B) barrières de maillage et (C) confinements piège/domaine — avec la trajectoire tracée pour une seule molécule (rouge). Les cercles bleus désignent l’intersection de la membrane et du faisceau laser de la taille ω. (Panneaux inférieurs) Lois de diffusion FCS représentées en traçant le temps de diffusion td en fonction du rayon carré ω2. La projection de la loi de diffusion (ligne pointillée verte) intercepte l’axe temporel à (A) l’origine (t0 = 0) dans le cas de la libre diffusion; (B) dans l’axe négatif (t0 &lt; 0) lorsqu’il y a des barrières de maillage, ou (C) dans l’axe positif (t0 &gt; 0) lorsqu’il y a des pièges et des domaines (radeaux lipidiques). D est le coefficient de diffusion latérale pour le mouvement brownien; Deff, le coefficient de diffusion effectif; Dmicro, le coefficient de diffusion microscopique à l’intérieur des pièges maillés; Din, le coefficient de diffusion à l’intérieur des domaines; Dout, le coefficient de diffusion en dehors des domaines; L, la taille du côté d’un domaine carré; et rD, le rayon d’un domaine circulaire. Ce chiffre a été modifié à partir de He et Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Figure 2 : Vue schématique du contrôle matériel svFCS. L’ordinateur contrôle tous les appareils via différents protocoles de communication: série (microscope, obturateur externe), USB (étage piézoélectrique XYZ, corrélateur) et PCI (carte d’acquisition). DAQ : carte d’acquisition de données, APD : photodiode d’avalanche, SPCM : module de comptage monophotonique, DO : sortie numérique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Figure 3 : Vue schématique des chemins optiques d’excitation et d’émission de la configuration svFCS. La configuration svFCS contient quatre modules: (1) la sortie d’un laser à fibre de 488 nm est collimée, (2) une combinaison d’une plaque demi-onde et d’un séparateur de faisceau polarisant définit la puissance optique, (3) le faisceau laser focalisé sur l’échantillon après avoir voyagé à travers un microscope motorisé sans lentille tubulaire, et (4) la fluorescence est détectée par un chemin de détection confocal sur une photodiode d’avalanche couplée à un seul module de comptage de photons, qui délivre un signal à un corrélateur matériel. La simplicité confère au système sa sensibilité, sa robustesse et sa facilité d’utilisation (largement commenté dans Supplementary material). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Figure 4 : Les lois de diffusion svFCS générées par l’analyse de diffusion de Thy1-GFP exprimées en Cos-7. lois de diffusion svFCS des cellules Cos-7 sans traitement (NT, carrés noirs) et après traitement par cholestérol oxydase (COase, cercles gris). L’encart dans le graphique représente le test statistique d’une différence significative entre les deux lois de diffusion svFCS présentées (selon Mailfert et al.28). La valeur d’essai (T) doit être supérieure au seuil fixé à 3,8 lorsque les deux lois de diffusion sont différentes. Plus il est élevé, plus la différence entre les lois de diffusion est grande. La valeur de T est codée par couleur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Figure 5 : Comparaison de la teneur en cholestérol total dans les cellules Cos-7. Les cellules Cos-7 ont été soit non traitées (NT), soit traitées avec 1 U/mL de cholestérol oxydase (COase) pendant 1 h. Les données représentent un exemple d’expérience en trois exemplaires. Un test t à deux queues et non apparié a été utilisé pour évaluer la différence statistique (α = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau des matières: Liste des éléments optiques requis pour la configuration svFCS.
Matériel supplémentaire : Ce document décrit la création d’une configuration svFCS à partir de zéro. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Cet article vise à présenter un protocole sur la façon de construire un microscope svFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) à variation ponctuelle pour mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes.

Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

La vision actuelle de l’organisation latérale de la membrane plasmique reste incomplète. Pour cette raison, il est important de mettre en œuvre de nouvelles techniques innovantes telles que la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle. Il s’agit d’une technique très puissante caractérisée par une excellente résolution temporelle et spatiale.De plus, il est non invasif et permet d’étudier les membranes cellulaires dans des conditions physiologiques. Chaque jour avant de réaliser une expérience, ouvrez tous les diaphragmes de l’iris et utilisez un wattmètre pour mesurer la puissance du laser avec le premier iris complètement ouvert. Tournez la plaque à mi-chemin pour localiser la puissance maximale.Si la puissance du laser est plus faible que d’habitude, utilisez les iris pour vérifier l’alignement et déplacez alternativement L1 et M1 si nécessaire. Notez ensuite la valeur de puissance dans un cahier de laboratoire. Pour vérifier le chemin de détection, placez de l’eau, une lamelle et une gouttelette de deux solutions nanomolaires de rhodamine 6G sur l’objectif.Lancez ensuite le logiciel de corrélation et enregistrez les données. La fonction d’autocorrélation doit afficher une faible quantité de bruit, une petite taille de déchets et un taux de comptage élevé par molécule et par seconde. Pour calibrer la taille du spot, placez une lamelle codée pour la culture cellulaire sur l’objectif d’immersion dans l’eau et ajoutez 200 microlitres de deux nanomolaires de solution de rhodamine 6G dans la lamelle.Ajustez la puissance du faisceau laser de 488 nanomètres à 300 microwatts et, dans le logiciel, sélectionnez le port du microscope de détection d’éclairage svFCS. Allumez l’APD et ouvrez l’iris jusqu’à ce qu’un signal tombe pour obtenir la taille minimale des déchets ou fermez-le pour une taille de déchets plus grande. Enregistrez environ 10 à 20 secondes de fonctions de corrélation automatique pour améliorer la reproductibilité statistique et désactivez l’APD.Dans le cadre d’un programme d’analyse de données approprié, vérifiez et éliminez les exécutions présentant de fortes fluctuations dues à des agrégats moléculaires, puis ajustez la moyenne de la fonction d’autocorrélation retenue avec un modèle de diffusion 3D, extrayez le temps de diffusion moyen des paramètres d’ajustement et enregistrez les données sous forme de fichier TXT. Pour l’analyse svFCS, ajustez le faisceau de 488 nanomètres alimenté entre deux et quatre microwatts et équilibrez les échantillons pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Sélectionnez le port du microscope de détection d’éclairage svFCS et sur l’APD.Ensuite, effectuez un balayage XY et un balayage Z de la cellule sélectionnée. Sélectionnez la membrane plasmique en haut de la cellule pour localiser le point confocal à l’intensité de fluorescence maximale et commencer l’acquisition des données. Dans le logiciel de corrélation, enregistrez une série de 20 exécutions de cinq secondes.Après la dernière exécution, désactivez l’APD et ignorez toutes les exécutions inattendues comme illustré. Ajustez la fonction d’autocorrélation moyenne avec un modèle de diffusion 2D à deux espèces et enregistrez les paramètres d’ajustement dans le fichier TXT précédemment enregistré. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été enregistrées, analysez au moins quatre tailles de déchets variant entre 200 et 400 nanomètres pour établir une seule loi de diffusion.Ensuite, dans MATLAB, sélectionnez un dossier contenant tous les fichiers TXT correspondant à au moins quatre expériences de taille de déchet et tracez le temps de diffusion en fonction du déchet carré. Sur cette figure, on peut observer une loi de diffusion pour Thy1-GFP exprimée dans les cellules Cos7. La loi de diffusion a une valeur de temps zéro positive, indiquant que le Thy1-GFP est confiné dans les structures de domaine nano de la membrane plasmique.Dans cette analyse, le traitement au cholestérol oxydase des cellules exprimant Thy1-GFP a entraîné le décalage de la valeur du temps zéro de la loi de diffusion à 7,36 plus ou moins 1,34 millisecondes. Confirmant que la nature du confinement de Thy1-GFP dépend de la teneur en cholestérol et est associée à des nano-domaines de radeau lipidique. Une diminution faible mais significative de la teneur en cholestérol total a également été observée lors du traitement au cholestérol oxydase.Comme cette enzyme n’agit que sur le pool de cholestérol accessible au feuillet externe de la membrane plasmique, ces données suggèrent que la diminution observée du cholestérol n’est associée qu’à la membrane plasmique et provoque une déstabilisation des nano-domaines du radeau lipidique. La chose la plus importante lors de la tentative de cette procédure est l’étalonnage correct du système svFCS et la préparation des cellules pour l’analyse. svFCS est un excellent outil pour étudier l’organisation de la membrane cellulaire.Cependant, il peut également être utilisé pour analyser la diffusion de molécules intracellulaires. Cette technique peut être mise en œuvre avec succès en biomédecine afin de déterminer l’influence des médicaments potentiels sur les cellules vivantes telles que les cellules cancéreuses.

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. L'acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l'addition de drogues.

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

Cette vidéo montre l’utilisation de la spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour détecter l’interaction entre les protéines de surface cellulaire au niveau des contacts cellule-cellule. En exprimant le récepteur d’adhésion transmembranaire d’intérêt marqué par une protéine fluorescente et en mélangeant deux populations cellulaires différentes hébergeant deux marqueurs fluorescents séparés spectralement, la trans-interaction entre les récepteurs de deux cellules voisines avec une...

Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’interaction des protéines aux contacts cellulaires

Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d'analyse de fluctuation k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.

Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Une méthode de mesure de la diffusion des protéines dans les membranes des cellules immunitaires primaires à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est décrite. Dans cet article, l’utilisation d’anticorps pour le marquage fluorescent est illustrée.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

Cet article décrit une méthode d’évaluation des interactions et des assemblages de protéines membranaires intégrales in vitro avec divers facteurs partenaires dans un environnement lipido-proximal.

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal In vitro

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

Systèmes automatisés et protocoles pour l’établissement systématique d’un grand nombre d’écrans et des gouttelettes de cristallisation nanolitres pour expériences de diffusion de vapeur sont décrites et discutées.

Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

Nous présentons ici un protocole expérimental qui peut être employé pour déterminer les affinités de liaison et le mode d’interaction de protéine se liant à phospholipides exempte d’étiquette annexine A2 avec immobilisée-prise en charge solide bicouches (SLB) de mesurer simultanément la absorption massive et les propriétés viscoélastiques de la protéine annexin A2.

Microgravimétrie dissipatif pour étudier la dynamique de la liaison des phospholipides Binding Protein annexine A2 de bicouches lipidiques solide soutenu par utilisant un résonateur à Quartz

Apprenez la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour analyser la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette technique non invasive offre une excellente résolution spatiale et temporelle.

Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal

Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes

Explorer plus de vidéos