Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes
12 novembre 2020
Cet article vise à présenter un protocole sur la façon de construire un microscope svFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) à variation ponctuelle pour mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes.
La vision actuelle de l’organisation latérale de la membrane plasmique reste incomplète. Pour cette raison, il est important de mettre en œuvre de nouvelles techniques innovantes telles que la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle. Il s’agit d’une technique très puissante caractérisée par une excellente résolution temporelle et spatiale.
De plus, il est non invasif et permet d’étudier les membranes cellulaires dans des conditions physiologiques. Chaque jour avant de réaliser une expérience, ouvrez tous les diaphragmes de l’iris et utilisez un wattmètre pour mesurer la puissance du laser avec le premier iris complètement ouvert. Tournez la plaque à mi-chemin pour localiser la puissance maximale.
Si la puissance du laser est plus faible que d’habitude, utilisez les iris pour vérifier l’alignement et déplacez alternativement L1 et M1 si nécessaire. Notez ensuite la valeur de puissance dans un cahier de laboratoire. Pour vérifier le chemin de détection, placez de l’eau, une lamelle et une gouttelette de deux solutions nanomolaires de rhodamine 6G sur l’objectif.
Lancez ensuite le logiciel de corrélation et enregistrez les données. La fonction d’autocorrélation doit afficher une faible quantité de bruit, une petite taille de déchets et un taux de comptage élevé par molécule et par seconde. Pour calibrer la taille du spot, placez une lamelle codée pour la culture cellulaire sur l’objectif d’immersion dans l’eau et ajoutez 200 microlitres de deux nanomolaires de solution de rhodamine 6G dans la lamelle.
Ajustez la puissance du faisceau laser de 488 nanomètres à 300 microwatts et, dans le logiciel, sélectionnez le port du microscope de détection d’éclairage svFCS. Allumez l’APD et ouvrez l’iris jusqu’à ce qu’un signal tombe pour obtenir la taille minimale des déchets ou fermez-le pour une taille de déchets plus grande. Enregistrez environ 10 à 20 secondes de fonctions de corrélation automatique pour améliorer la reproductibilité statistique et désactivez l’APD.
Dans le cadre d’un programme d’analyse de données approprié, vérifiez et éliminez les exécutions présentant de fortes fluctuations dues à des agrégats moléculaires, puis ajustez la moyenne de la fonction d’autocorrélation retenue avec un modèle de diffusion 3D, extrayez le temps de diffusion moyen des paramètres d’ajustement et enregistrez les données sous forme de fichier TXT. Pour l’analyse svFCS, ajustez le faisceau de 488 nanomètres alimenté entre deux et quatre microwatts et équilibrez les échantillons pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Sélectionnez le port du microscope de détection d’éclairage svFCS et sur l’APD.
Ensuite, effectuez un balayage XY et un balayage Z de la cellule sélectionnée. Sélectionnez la membrane plasmique en haut de la cellule pour localiser le point confocal à l’intensité de fluorescence maximale et commencer l’acquisition des données. Dans le logiciel de corrélation, enregistrez une série de 20 exécutions de cinq secondes.
Après la dernière exécution, désactivez l’APD et ignorez toutes les exécutions inattendues comme illustré. Ajustez la fonction d’autocorrélation moyenne avec un modèle de diffusion 2D à deux espèces et enregistrez les paramètres d’ajustement dans le fichier TXT précédemment enregistré. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été enregistrées, analysez au moins quatre tailles de déchets variant entre 200 et 400 nanomètres pour établir une seule loi de diffusion.
Ensuite, dans MATLAB, sélectionnez un dossier contenant tous les fichiers TXT correspondant à au moins quatre expériences de taille de déchet et tracez le temps de diffusion en fonction du déchet carré. Sur cette figure, on peut observer une loi de diffusion pour Thy1-GFP exprimée dans les cellules Cos7. La loi de diffusion a une valeur de temps zéro positive, indiquant que le Thy1-GFP est confiné dans les structures de domaine nano de la membrane plasmique.
Dans cette analyse, le traitement au cholestérol oxydase des cellules exprimant Thy1-GFP a entraîné le décalage de la valeur du temps zéro de la loi de diffusion à 7,36 plus ou moins 1,34 millisecondes. Confirmant que la nature du confinement de Thy1-GFP dépend de la teneur en cholestérol et est associée à des nano-domaines de radeau lipidique. Une diminution faible mais significative de la teneur en cholestérol total a également été observée lors du traitement au cholestérol oxydase.
Comme cette enzyme n’agit que sur le pool de cholestérol accessible au feuillet externe de la membrane plasmique, ces données suggèrent que la diminution observée du cholestérol n’est associée qu’à la membrane plasmique et provoque une déstabilisation des nano-domaines du radeau lipidique. La chose la plus importante lors de la tentative de cette procédure est l’étalonnage correct du système svFCS et la préparation des cellules pour l’analyse. svFCS est un excellent outil pour étudier l’organisation de la membrane cellulaire.
Cependant, il peut également être utilisé pour analyser la diffusion de molécules intracellulaires. Cette technique peut être mise en œuvre avec succès en biomédecine afin de déterminer l’influence des médicaments potentiels sur les cellules vivantes telles que les cellules cancéreuses.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour construire un microscope de spectroscopie de corrélation de fluorescence en variation de spot (svFCS) afin de mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique de cellules vivantes. La technique offre une excellente résolution temporelle et spatiale tout en étant non invasive.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Microscopie de fluorescence
Contexte
- L'organisation latérale de la membrane plasmique n'est pas entièrement comprise.
- Des techniques innovantes comme la svFCS sont nécessaires pour obtenir de meilleures informations.
- La svFCS permet l'étude des membranes cellulaires dans des conditions physiologiques.
- Un calibrage adéquat et une préparation soigneuse des cellules sont essentiels pour des résultats précis.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole de microscopie svFCS.
- Mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique.
- Analyser l'influence du cholestérol sur l'organisation membranaire.
Méthodes utilisées
- Étalonnage du système svFCS à l'aide d'une solution de rhodamine 6G.
- Acquisition des données par balayage XY et en Z de cellules sélectionnées.
- Analyse des lois de diffusion à l'aide de MATLAB.
- Comparaison des paramètres de diffusion avant et après traitement par la cholestérol oxydase.
Résultats principaux
- La diffusion de Thy1-GFP est confinée au sein de structures de nanodomains.
- Le traitement par la cholestérol oxydase modifie la valeur initiale de la loi de diffusion.
- Une diminution de la teneur totale en cholestérol a été observée.
- L'étude suggère que le cholestérol influence la stabilité des radeaux lipidiques.
Conclusions
- La svFCS est efficace pour l'étude de l'organisation de la membrane cellulaire.
- La technique permet également d'analyser la diffusion des molécules intracellulaires.
- Les résultats ont des implications pour la compréhension des effets des médicaments sur les cellules vivantes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La spectroscopie de corrélation de fluorescence par variation de tache (svFCS) permet une analyse à haute résolution de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique dans des conditions physiologiques, offrant des informations essentielles sur l'organisation membranaire et la dynamique des radeaux lipidiques. Cette capacité soutient la validation de cibles en élucidant le contexte biophysique des protéines associées à la membrane, apportant des éléments clés pour la dé-risque mécanistique en phase précoce de découverte. Le caractère non invasif de la méthode et sa compatibilité avec les cellules vivantes renforcent son utilité dans les criblages précliniques et les études translationnelles de biomarqueurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en quantifiant le comportement de diffusion de protéines membranaires telles que Thy1-GFP au sein de structures en nanodomaines.
- Valeur opérationnelle : Révèle un confinement dépendant du cholestérol, permettant une validation fonctionnelle des associations avec les radeaux lipidiques.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en identifiant des cibles dont la localisation membranaire est sensible aux perturbations de l'environnement lipidique.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en établissant les lois de diffusion de base dans des conditions physiologiques.
- Production quantitative : Génère des mesures reproductibles du temps de diffusion pour différentes tailles de waist du faisceau, soutenant la standardisation des essais.
- Pertinence pour le criblage : Détecte les décalages induits par les composés dans les paramètres de diffusion, indiquant des modifications de l'organisation membranaire ou de l'interaction avec la cible.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise la perturbation des nanodomaines des radeaux de la membrane plasmique, pertinente pour les pathologies impliquant une dysrégulation lipidique.
- Continuité translationnelle : Relie les observations de découverte précoce à la validation préclinique en démontrant comment des perturbations environnementales (par exemple, la modulation du cholestérol) modifient le comportement de la cible.
- Décisions ajustées au risque : Fournit des lectures mécanistiques permettant d'établir des critères d'engagement ou de non-engagement fondés sur la résilience de la cible face aux perturbations membranaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La svFCS s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur la cible à l'identification de candidats puis à la validation préclinique, en offrant une couche de caractérisation biophysique qui complète les essais biochimiques et phénotypiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en mesurant les coefficients de diffusion et en identifiant les populations moléculaires confinées par rapport aux populations mobiles.
- Essais de criblage : Permet la préparation des tests grâce à un étalonnage standardisé utilisant la rhodamine 6G et à la validation de l'intégrité du chemin de détection.
- Analytique : Fournit des lois quantitatives de diffusion par l'analyse sous MATLAB des fonctions d'autocorrélation, permettant la comparaison du comportement moléculaire dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Associe les modifications de l'organisation membranaire à des conséquences fonctionnelles, facilitant l'alignement de biomarqueurs lorsque les changements de diffusion sont corrélés à des réponses phénotypiques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude de la dynamique des protéines membranaires sur plusieurs cibles et lignées cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en résolvant la confinement nanométrique et l'hétérogénéité de la diffusion au niveau de la membrane plasmique.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à un étalonnage standardisé de la puissance laser, à des vérifications du trajet de détection et à une moyenne des fonctions d'auto-corrélation répétées.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en quantifiant la stabilité de la cible dans des environnements membranaires proches du natif, réduisant ainsi l'élimination en phase avancée due à des défauts biophysiques imprévus.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles en fonction de leur dépendance à l'intégrité des radeaux lipidiques pour une localisation et une fonction adéquates.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence, en sécurité laser et en analyse de données de spectroscopie de corrélation.
- Exige un microscope à fluorescence personnalisé équipé d'une photodiode à avalanche (APD), d'un logiciel de corrélation et d'un contrôle précis de la puissance laser (2–4 µW pour les mesures svFCS).
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles d'étalonnage (par exemple, validation de la taille du spot de la rhodamine 6G) et des pipelines d'analyse des données (par exemple, ajustement de modèles de diffusion 2D sous MATLAB).
- Suppose des adaptations pour différents types de protéines membranaires, de cellules et d'agents de perturbation autres que l'oxydase du cholestérol.
- Est limité par la nécessité d'une préparation minutieuse des échantillons afin d'éviter les agrégats moléculaires et de garantir la pertinence physiologique durant l'équilibration à 37 °C.
