Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes
November 12th, 2020
Cet article vise à présenter un protocole sur la façon de construire un microscope svFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) à variation ponctuelle pour mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes.
La vision actuelle de l’organisation latérale de la membrane plasmique reste incomplète. Pour cette raison, il est important de mettre en œuvre de nouvelles techniques innovantes telles que la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle. Il s’agit d’une technique très puissante caractérisée par une excellente résolution temporelle et spatiale.
De plus, il est non invasif et permet d’étudier les membranes cellulaires dans des conditions physiologiques. Chaque jour avant de réaliser une expérience, ouvrez tous les diaphragmes de l’iris et utilisez un wattmètre pour mesurer la puissance du laser avec le premier iris complètement ouvert. Tournez la plaque à mi-chemin pour localiser la puissance maximale.
Si la puissance du laser est plus faible que d’habitude, utilisez les iris pour vérifier l’alignement et déplacez alternativement L1 et M1 si nécessaire. Notez ensuite la valeur de puissance dans un cahier de laboratoire. Pour vérifier le chemin de détection, placez de l’eau, une lamelle et une gouttelette de deux solutions nanomolaires de rhodamine 6G sur l’objectif.
Lancez ensuite le logiciel de corrélation et enregistrez les données. La fonction d’autocorrélation doit afficher une faible quantité de bruit, une petite taille de déchets et un taux de comptage élevé par molécule et par seconde. Pour calibrer la taille du spot, placez une lamelle codée pour la culture cellulaire sur l’objectif d’immersion dans l’eau et ajoutez 200 microlitres de deux nanomolaires de solution de rhodamine 6G dans la lamelle.
Ajustez la puissance du faisceau laser de 488 nanomètres à 300 microwatts et, dans le logiciel, sélectionnez le port du microscope de détection d’éclairage svFCS. Allumez l’APD et ouvrez l’iris jusqu’à ce qu’un signal tombe pour obtenir la taille minimale des déchets ou fermez-le pour une taille de déchets plus grande. Enregistrez environ 10 à 20 secondes de fonctions de corrélation automatique pour améliorer la reproductibilité statistique et désactivez l’APD.
Dans le cadre d’un programme d’analyse de données approprié, vérifiez et éliminez les exécutions présentant de fortes fluctuations dues à des agrégats moléculaires, puis ajustez la moyenne de la fonction d’autocorrélation retenue avec un modèle de diffusion 3D, extrayez le temps de diffusion moyen des paramètres d’ajustement et enregistrez les données sous forme de fichier TXT. Pour l’analyse svFCS, ajustez le faisceau de 488 nanomètres alimenté entre deux et quatre microwatts et équilibrez les échantillons pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Sélectionnez le port du microscope de détection d’éclairage svFCS et sur l’APD.
Ensuite, effectuez un balayage XY et un balayage Z de la cellule sélectionnée. Sélectionnez la membrane plasmique en haut de la cellule pour localiser le point confocal à l’intensité de fluorescence maximale et commencer l’acquisition des données. Dans le logiciel de corrélation, enregistrez une série de 20 exécutions de cinq secondes.
Après la dernière exécution, désactivez l’APD et ignorez toutes les exécutions inattendues comme illustré. Ajustez la fonction d’autocorrélation moyenne avec un modèle de diffusion 2D à deux espèces et enregistrez les paramètres d’ajustement dans le fichier TXT précédemment enregistré. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été enregistrées, analysez au moins quatre tailles de déchets variant entre 200 et 400 nanomètres pour établir une seule loi de diffusion.
Ensuite, dans MATLAB, sélectionnez un dossier contenant tous les fichiers TXT correspondant à au moins quatre expériences de taille de déchet et tracez le temps de diffusion en fonction du déchet carré. Sur cette figure, on peut observer une loi de diffusion pour Thy1-GFP exprimée dans les cellules Cos7. La loi de diffusion a une valeur de temps zéro positive, indiquant que le Thy1-GFP est confiné dans les structures de domaine nano de la membrane plasmique.
Dans cette analyse, le traitement au cholestérol oxydase des cellules exprimant Thy1-GFP a entraîné le décalage de la valeur du temps zéro de la loi de diffusion à 7,36 plus ou moins 1,34 millisecondes. Confirmant que la nature du confinement de Thy1-GFP dépend de la teneur en cholestérol et est associée à des nano-domaines de radeau lipidique. Une diminution faible mais significative de la teneur en cholestérol total a également été observée lors du traitement au cholestérol oxydase.
Comme cette enzyme n’agit que sur le pool de cholestérol accessible au feuillet externe de la membrane plasmique, ces données suggèrent que la diminution observée du cholestérol n’est associée qu’à la membrane plasmique et provoque une déstabilisation des nano-domaines du radeau lipidique. La chose la plus importante lors de la tentative de cette procédure est l’étalonnage correct du système svFCS et la préparation des cellules pour l’analyse. svFCS est un excellent outil pour étudier l’organisation de la membrane cellulaire.
Cependant, il peut également être utilisé pour analyser la diffusion de molécules intracellulaires. Cette technique peut être mise en œuvre avec succès en biomédecine afin de déterminer l’influence des médicaments potentiels sur les cellules vivantes telles que les cellules cancéreuses.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour construire un microscope de spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle (svFCS) afin de mesurer la diffusion moléculaire à la membrane plasmique des cellules vivantes. La technique offre une excellente résolution temporelle et spatiale tout en étant non invasive.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Microscopie à fluorescence
Contexte
- L'organisation latérale de la membrane plasmique n'est pas entièrement comprise.
- Des techniques innovantes comme le svFCS sont nécessaires pour de meilleures connaissances.
- Le svFCS permet d'étudier les membranes cellulaires dans des conditions physiologiques.
- Une calibration et une préparation cellulaire appropriées sont cruciales pour des résultats précis.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour la microscopie svFCS.
- Mesurer la diffusion moléculaire à la membrane plasmique.
- Analyser l'influence du cholestérol sur l'organisation membranaire.
Méthodes utilisées
- Calibration du système svFCS en utilisant une solution de rhodamine 6G.
- Acquisition de données par balayages XY et Z de cellules sélectionnées.
- Analyse des lois de diffusion à l'aide de MATLAB.
- Comparaison des paramètres de diffusion avant et après traitement à l'oxdase de cholestérol.
Résultats principaux
- La diffusion de Thy1-GFP est confinée dans des structures de domaine nanométrique.
- Le traitement à l'oxdase de cholestérol décale la valeur du temps zéro de la loi de diffusion.
- Une diminution du contenu total en cholestérol a été observée.
- L'étude suggère que le cholestérol influence la stabilité des radeaux lipidiques.
Conclusions
- Le svFCS est efficace pour étudier l'organisation des membranes cellulaires.
- La technique peut également analyser la diffusion des molécules intracellulaires.
- Les résultats ont des implications pour comprendre les effets des médicaments sur les cellules vivantes.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) enables high-resolution analysis of molecular diffusion at the plasma membrane under physiological conditions, providing critical insights into membrane organization and lipid raft dynamics. This capability supports target validation by elucidating the biophysical context of membrane-associated proteins, informing mechanistic de-risking in early discovery. The method’s non-invasive nature and compatibility with living cells enhance its utility in preclinical screening and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of membrane proteins like Thy1-GFP within nanodomain structures.
- Operational Value: Reveals cholesterol-dependent confinement, enabling functional validation of lipid raft associations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets whose membrane localization is sensitive to lipid environment perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline diffusion laws under physiological conditions.
- Quantitative Output: Generates reproducible diffusion time measurements across varying beam waist sizes, supporting assay standardization.
- Screening Relevance: Detects compound-induced shifts in diffusion parameters, indicating alterations in membrane organization or target engagement.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plasma membrane raft nanodomain disruption, relevant to pathologies involving lipid dysregulation.
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical validation by demonstrating how environmental perturbations (e.g., cholesterol modulation) alter target behavior.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic readouts that inform go/no-go criteria based on target resilience to membrane perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
svFCS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a biophysical layer of characterization that complements biochemical and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring diffusion coefficients and identifying confined vs. mobile molecular populations.
- Screening: Enables assay readiness through standardized calibration using rhodamine 6G and validation of detection path integrity.
- Analytics: Delivers quantitative diffusion laws via MATLAB analysis of auto correlation functions, allowing comparison of molecular behavior across conditions.
- Translational Research: Links membrane organization changes to functional outcomes, supporting biomarker alignment when diffusion shifts correlate with phenotypic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying membrane protein dynamics across multiple targets and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving nanoscale confinement and diffusion heterogeneity at the plasma membrane.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized laser power calibration, detection path checks, and replicate auto correlation function averaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target stability in native-like membrane environments, reducing late-stage attrition due to unforeseen biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their dependence on lipid raft integrity for proper localization and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, laser safety, and correlation spectroscopy data analysis.
- Needs a customized fluorescence microscope with APD, correlator software, and precise laser power control (2–4 µW for svFCS measurements).
- Demands cross-team standardization of calibration protocols (e.g., rhodamine 6G spot size validation) and data analysis pipelines (e.g., MATLAB fitting of 2D diffusion models).
- Involves adaptation considerations for different membrane proteins, cell types, and perturbation agents beyond cholesterol oxidase.
- Limited by the need for careful sample preparation to avoid molecular aggregates and ensure physiological relevance during 37°C equilibration.
