Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation

Cette méthode permet de générer de la tubuline pure capable d’être assemblée avec des modifications post-traductionnelles définies en quantités suffisantes pour réaliser des séries entières d’expériences in vitro. Ce protocole basé sur des cycles de polymérisation et de dépolymérisation de la tubuline est facile à réaliser dans n’importe quel laboratoire de biologie cellulaire. Il permet de générer de bonnes quantités de tubuline avec très peu de temps de manipulation.

Pour purifier la tubuline à partir de cultures en suspension, neuf jours avant la préparation de la tubuline, raviver et amplifier le type de cellule souhaité pour obtenir six boîtes confluentes de 15 centimètres. Huit jours avant la préparation de la tubuline, ajoutez un litre de milieu préchauffé à chaque bouteille tournante par plat sous une armoire de culture cellulaire et placez les essoreuses sur une table d’agitation à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire. Laissez les capuchons latéraux de la toupie légèrement ouverts pour permettre au fluide de s’équilibrer avec l’atmosphère de l’incubateur.

Le lendemain, utilisez les cellules des paraboles confluentes pour inoculer les bouteilles essoreuses. Remettez les flacons essoreurs dans l’incubateur pendant une semaine avec les valves latérales légèrement ouvertes. Pour récolter les cellules, transférez les cultures des bouteilles centrifuges dans des bouteilles à centrifuger d’un litre et collectez les cellules par centrifugation.

Remettez chaque pastille en suspension dans 10 millilitres de PBS glacé et regroupez les cellules remises en suspension dans un tube de 50 millilitres pour une centrifugation à quatre degrés Celsius. Pour une pastille cellulaire de 10 millilitres, ajoutez 10 millilitres de tampon de lyse à la pastille et retournez le tube plusieurs fois pour remettre les cellules en suspension. Pour purifier la tubuline à partir de cultures cellulaires adhérentes, ravivez et amplifiez le type de cellule souhaité pour obtenir 10 plats confluents de 15 centimètres le jour de la préparation de la tubuline.

Pour récolter les cellules adhérentes, en traitant trois boîtes à la fois, inclinez les boîtes de culture pour retirer le milieu pendant qu’une deuxième personne lave doucement les cellules avec sept millilitres de PBS-EDTA. Après le lavage, la deuxième personne doit traiter les cellules avec cinq millilitres de PBS-EDTA par plat avant qu’une troisième personne n’utilise un lève-cellules pour pousser doucement les cellules vers un bord de la boîte. Lorsque les cellules ont été détachées, regroupez les cellules des trois boîtes dans un tube de 50 millilitres sur de la glace et rincez chaque plaque avec deux millilitres supplémentaires de PBS-EDTA pour recueillir les cellules restantes.

Après avoir collecté les cellules par centrifugation, jetez le surnageant pour déterminer le volume de la pastille cellulaire. Ajoutez le tampon de lyse, remettez les cellules en suspension et transférez-les dans un tube à fond rond de 14 millilitres. Soniquez les cellules pendant environ 45 impulsions.

Pour la lyse du cerveau de souris, ajoutez 500 microlitres de tampon homologué à un seul cerveau prélevé sur une souris adulte et utilisez un mélangeur de tissus pour lyser le tissu. Après avoir obtenu le lysat à 1/100e de son volume à un volume égal de 2X Laemmli, tamponnez et faites bouillir la solution pendant cinq minutes. Conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit quantifié.

Prélevez un échantillon de cette façon à chaque étape de la préparation de la tubuline. Pour clarifier le lysat, centrifugez l’échantillon et utilisez une longue aiguille pour transférer soigneusement le surnageant transparent dans un nouveau tube, en prenant soin d’éviter la couche supérieure flottante. Après la clarification du lysat, il est essentiel d’éliminer la matière flottante dans le surnageant, sinon cela pourrait affecter négativement l’efficacité de la purification de la tubuline.

Pour polymériser la tubuline à partir du lysat clarifié, mélangez tout le volume du surnageant avec un volume de 1/200e de GTP molaire et un demi-volume de glycérol chaud dans un tube de taille appropriée. Pipetez doucement le mélange, en prenant soin d’éviter d’introduire des bulles d’air. Fermez les tubes avec du parafilm et placez-les dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube. Pour dépolymériser les microtubules présents dans la pastille deux, remettez la pastille en suspension dans du BRB 80 glacé pendant cinq minutes sur de la glace. Pipeter l’échantillon d’abord avec une pipette P1000, puis avec une pipette P200, toutes les cinq minutes pendant 20 minutes sur de la glace.

Une fois que l’échantillon est homogène, centrifugez-le et transférez le surnageant obtenu dans un nouveau tube. Pour éliminer les protéines associées aux microtubules de la tubuline, mélangez tout le volume du surnageant trois avec un volume égal de tube molaire préchauffé S, le même volume de glycérol préchauffé et un volume de 1/100e de 0,2 molaire GTP. Incuber le mélange pendant 20 minutes à 30 degrés Celsius avant de le centrifuger.

Transférez le surnageant contenant la protéine quatre associée aux microtubules dans un nouveau tube, la pastille contient des microtubules polymérisés. Après avoir effectué une troisième polymérisation et dépolymérisation, la quantité de tubuline récoltée peut être quantifiée par analyse de la page SDS. Le succès du processus de purification peut être confirmé sur une page SDS colorée à Coomassie.

Un rendement plus faible que prévu de la tubuline purifiée peut être dû à une polymérisation inefficace de la tubuline, comme en témoigne la quantité plus faible de tubuline dans les deuxième, quatrième et sixième fractions de pastilles et une quantité plus élevée dans les deuxième, quatrième et sixième fractions surnageantes. Pour quantifier la tubuline purifiée, les échantillons peuvent être analysés à côté de quantités connues d’albumine sérique bovine. La densitométrie quantitative des bandes protéiques permet alors de calculer la quantité de tubuline purifiée.

L’état de modification de la tubuline peut être confirmé par l’analyse immuno-blot des échantillons. Notre protocole permet l’isolement de la tubuline avec des modifications post-traductionnelles contrôlées. Avec cette tubuline, nous pouvons mettre en place des expériences de reconstitution in vitro qui nous permettent de déterminer l’impact des modifications de la tubuline sur les propriétés microtubaires, ainsi que sur leurs interactions avec les protéines associées aux microtubules.