Alimentation et quantification du sang d’origine animale et des repas artificiels chez les moustiques Aedes aegypti

Cette technique permet aux chercheurs de se nourrir et d’effectuer à eux seuls des mesures à haut débit pour comparer les volumes de repas consommés par des centaines de moustiques individuels. Il peut être adaptatif pour modifier le contenu du repas ou pour comparer le volume consommé par différents groupes expérimentaux. Ce protocole se veut convivial et peu coûteux.

Pour des manipulations pharmacologiques et génétiques, pour étudier l’alimentation en sang des moustiques et le comportement alimentaire après une inondation. L’organisation est essentielle pour ce protocole. Préparez l’installation et les réactifs à l’avance, afin de pouvoir livrer rapidement les repas aux moustiques.

Pour commencer, transférez 1,98 à deux millilitres de sang de mouton défibriné dans un tube conique de 15 millilitres. Si vous effectuez une quantification de la taille du repas basée sur la fluorescence, ajoutez la solution de fluorescéine à une concentration finale de 0,002 %, réduisant ainsi le volume de sang de la même quantité que la fluorescéine ajoutée. Conserver un millilitre de la formulation finale du repas pour générer la courbe standard de référence.

Tous les repas et solutions contenant de la fluorescéine doivent être enveloppés dans du papier d’aluminium ou conservés à l’obscurité. Pour préparer des repas salins sans protéines, combinez 600 microlitres de bicarbonate de sodium de 400 millimolaires avec 1,39 millilitres d’eau distillée deux fois dans un tube conique de 15 millilitres. Si l’on doit ensuite effectuer une quantification de la taille du repas basée sur la fluorescence, ajouter la solution de fluorescéine à une concentration finale de 0,002 %, en réduisant le volume d’eau de la même quantité que la fluorescéine ajoutée.

Conserver au moins un millilitre de la formulation finale du tourteau contenant 0,002 % de fluorescéine pour générer la courbe étalon de référence. Mettez de côté les plats préparés jusqu’à ce que vous soyez prêt à les livrer. Tous les repas et solutions contenant de la fluorescéine doivent être enveloppés dans du papier d’aluminium ou conservés dans l’obscurité.

Placez le groupe expérimental de moustiques femelles dans un récipient et couvrez-les d’un grillage. Laissez ces femelles s’acclimater dans la chambre d’alimentation. Mettez de côté un groupe témoin de moustiques non nourris qui ne se verront pas offrir de repas.

Pour construire un tube GLI, remplissez un tube conique de 50 millilitres avec 40 millilitres de glycérol à 100 %. Scellez le tube conique ouvert avec deux morceaux de parafilm pour minimiser les risques de fuite. En option, maintenez le parafilm en place à l’aide d’élastiques.

Retournez le tube pour vous assurer qu’il n’y a pas de trous ou d’espaces. Pour créer le dispositif de livraison de repas, découpez un trou centré de 2,5 centimètres dans le bouchon à vis du tube conique à l’aide d’une lame de rasoir tranchante ou d’une lave. Étirez, un morceau de parafilm uniformément de sorte qu’il double grossièrement de volume.

Le parafilm doit être suffisamment fin pour que les moustiques puissent facilement le transpercer, mais il ne doit pas y avoir de fuites. Scellez la surface extérieure du bouchon à vis avec le parafilm pour couvrir complètement le trou et mettez le capuchon de côté. Chauffez à la fois le tube scellé de glycérol et les repas de sang et de sérum physiologique et un bain-marie de 42 à 45 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes.

Ajoutez de l’ATP au repas chaud et tourbillonnez abondamment. Pipetez deux millilitres du repas réchauffé dans la chambre intérieure du bouchon à vis et placez doucement le tube conique inversé rempli de glycérol réchauffé dessus. Vissez partiellement le bouchon avec le repas sur le tube rempli de glycérol, juste assez pour éviter les fuites du repas ou du glycérol.

Placez le tube de sperme assemblé sur le dessus du récipient à moustiques, appliquez du dioxyde de carbone et laissez les moustiques accéder à la nourriture pendant au moins 15 minutes pour atteindre des taux d’alimentation maximaux. Après l’alimentation, le capuchon du tube GLI peut être jeté comme déchet biologique ou réutilisé après trempage dans une solution d’eau de Javel à faible pourcentage et rinçage abondamment à l’eau. Pour générer une courbe standard de référence, préparez une dilution en série du même repas contenant 0,002 % de fluorescéine que celui qui a été proposé au groupe expérimental de moustiques.

Pour faire la première solution de la courbe standard, ajoutez 50 microlitres de tourteau contenant 0,002 % de fluorescéine à 950 microlitres de PBS et tourbillonnez complètement. Effectuez des dilutions doubles pour le reste des solutions de la courbe standard, en tourbillonnant bien avant chaque dilution. Pipeter 100 microlitres de chacune des solutions de courbe standard dans chacun des huit puits de la première colonne d’une plaque PCR à 96 puits.

Ajouter un moustique témoin non nourri anesthésié ou congelé dans chacun des huit mêmes puits. Répétez l’opération dans la deuxième colonne de la plaque pour une mesure répétée. Ajouter 100 microlitres de PBS dans chaque puits restant pour les groupes témoins et expérimentaux non alimentés.

Comme contrôle négatif, ajoutez un moustique non nourri dans chaque puits dans les deux colonnes suivantes de la plaque. Ajoutez un moustique par puits aux puits restants des groupes expérimentaux à qui on a offert un repas. Ajoutez des billes de verre solide borosilicaté de trois millimètres dans chaque puits si vous perturbez les tissus avec l’homogénéisateur du broyeur à billes.

Scellez soigneusement la plaque et perturbez le tissu, puis centrifugez la plaque à 2000 tr/min pendant une à deux minutes pour recueillir le lysat. Préparez une plaque noire de 96 puits avec 180 microlitres de PBS dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de lysat dans chaque puits et mélangez.

Mesurez l’intensité de la fluorescéine à l’aide d’un lecteur de plaques avec les canaux d’excitation 485 et d’émission 520. Générez la courbe standard de référence en traçant le volume connu de farine par rapport à la mesure de l’intensité de fluorescence correspondante. À l’aide de la courbe standard de référence générée, extrapoler le volume de repas ingéré par chacun des moustiques du groupe expérimental.

Soustrayez la lecture moyenne de l’intensité de fluorescence du groupe témoin négatif non nourri de la lecture de l’intensité de fluorescence de chaque individu du groupe expérimental pour corriger l’autofluorescence tissulaire de base. Pour mesurer la taille d’un repas de fluorescéine à partir d’une expérience d’alimentation sanguine, une courbe standard a été générée en traçant les lectures de fluorescence des puits de référence désignés contenant un moustique non nourri et un volume connu du repas avec 0,002 % de fluorescéine. Les lectures de fluorescence des puits restants qui contiennent des moustiques du groupe témoin négatif non nourri ou du groupe expérimental de moustiques à qui on a offert un repas sont comparées à cette courbe standard pour quantifier le volume de repas consommé.

Bien que toutes les femelles du groupe expérimental aient reçu le repas de sang, certaines moustiques se sont nourries et d’autres non. Ce protocole peut être utilisé pour livrer et quantifier des repas avec différentes compositions protéiques. Les données recueillies à l’aide de repas contenant de la fluoricine ajoutée sont présentées ici.

Une expérience indépendante où les moustiques ont été notés comme nourris ou non nourris à l’œil, après qu’on leur ait proposé des repas sans fluoricine, a également été réalisée. Ce protocole a été utilisé pour déterminer le volume consommé des repas avec des médicaments qui régulent le comportement de recherche des hôtes moustiques. Dans ces expériences, des femelles ont reçu des repas salins d’ATP avec un agoniste humain du récepteur NPY deux.

Cette technique a également été utilisée pour mesurer le comportement alimentaire du nectar, en remplaçant le tube de gly par une boule de coton saturée de 10 % de saccharose contenant 0,002 % de fluorescéine, démontrant qu’elle peut être utilisée pour mesurer des tailles de repas plus petites ou plus variables qui ne peuvent pas être discernées avec précision à partir des mesures de poids de groupe. La chose la plus importante lors de l’exécution de ce protocole est d’organiser les échantillons en événements et de mettre de côté les moustiques non nourris et un ML de chaque repas pour générer la courbe standard. Suite à cette procédure, le comportement des animaux après l’alimentation sanguine peut être observé et la digestion peut être suivie.

Cette méthode permet aux chercheurs d’évaluer les changements dans la consommation de repas chez les moustiques génétiquement modifiés. Il fournit également un moyen simple, rapide et non invasif d’administrer des médicaments aux moustiques et de tester leurs effets sur le comportement.