Mutagénèse par PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation du type sauvage et des formes mutantes de la tryptophane synthase

Ce protocole pour purifier l’enzyme tryptophane synthase de Salmonella typhimurium est rapide, simple et court. Le fractionnement du sulfate d’ammoniac et la chromatographie d’exclusion stérique permettent de purifier le type sauvage et le complexe tryptophane synthase mutante en une seule journée. Cette technique peut être appliquée pour purifier d’autres protéines apparentées, car le fractionnement du sulfate d’ammoniac et la chromatographie d’exclusion stérique sont couramment utilisés pour purifier les protéines non marquées.

Pour commencer, perturbez la pastille cellulaire par sonication sur un bain d’eau glacée à 80 % d’amplitude pendant 20 cycles à l’aide d’impulsions de 10 secondes et de repos de 20 secondes. Centrifugez le lysat cellulaire à 30 000 fois g pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius et aspirez le surnageant sans déloger la pastille. Filtrez la fraction surnageante clarifiée à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre à température ambiante.

Ajoutez lentement de petites quantités de sulfate d’ammonium au filtrat jusqu’à ce que la saturation de 20 % soit atteinte. Effectuez le fractionnement du sulfate d’ammonium à 25 degrés Celsius et remuez doucement la solution pendant 10 minutes, en prenant soin d’éviter les bulles. Centrifugez à nouveau la solution pendant 10 minutes et transférez le surnageant dans un flacon propre pour une utilisation ultérieure.

Remettez doucement la pastille en suspension dans 20 millilitres de tampon d’échantillon et préparez un échantillon pour exécuter SDS-PAGE. Ajoutez du sulfate d’ammonium au surnageant jusqu’à ce que la saturation de 30 % soit atteinte, et remuez la solution en évitant les bulles. Centrifugez à nouveau la solution pendant 10 minutes et transférez le surnageant dans un flacon propre pour une utilisation ultérieure.

Remettez doucement en suspension la fraction de granulés obtenue à 40 % dans 10 millilitres de tampon d’échantillon deux, et préparez un échantillon pour exécuter SDS-PAGE. Ensuite, microcentrifugez l’échantillon à 40 % de protéines à 10 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, et chargez le surnageant obtenu sur une colonne HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR préalablement équilibrée fixée à un instrument de chromatographie liquide protéique rapide à un débit de 0,5 millilitre par minute. Évaluez les fractions de pic collectées et les fractions de sulfate d’ammonium sur un gel SDS-PAGE à 12 % coloré au bleu brillant de Coomassie.

Concentrer le complexe tryptophane synthase de Salmonella typhimurium typhimurium de type sauvage ou mutant alpha-deux avec un filtre centrifuge de 100 kilodaltons en tournant à 3 000 fois g, à quatre degrés Celsius. Transférez la protéine concentrée dans un tube frais de deux millilitres, puis centrifugez-le à 10 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés pour éliminer les agrégats. Après avoir déterminé la concentration en protéines de l’échantillon, préparez des aliquotes de 0,5 millilitre à raison de 20 à 25 milligrammes par millilitre.

Congelez-les rapidement dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés. Préparez une solution mère de cinq millilitres de spermine de 200 millimolaires dans de l’eau et conservez-la dans des aliquotes de 500 microlitres à moins 20 degrés. Préparez ensuite une solution mère de 50 millilitres de polyéthylène glycol 8 000 à 30 % dans de l’eau et conservez 25 millilitres dans une fiole conique jetable de 50 millilitres à 25 degrés Celsius.

Préparez des solutions mères de 25 millilitres de chlorure de césium et de chlorure de sodium à une molaire, chacune dans de l’eau, et maintenez-les à 25 degrés Celsius. Préparez trois séries de solutions mères de 50 millilitres de bicine à une molaire et titrez-les avec de l’hydroxyde de césium ou de sodium pour obtenir des solutions tamponnées à pH 7,6, 7,8 et huit. Conservez des aliquotes de 25 millilitres des solutions à quatre degrés Celsius.

Décongeler un échantillon du complexe alpha-deux bêta-deux tryptophane synthase de Salmonella typhimurium dans un bain de glace. Ensuite, microcentrifugez-le à 10 000 fois g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Transférez la fraction surnageante claire dans un tube à centrifuger propre.

Estimez la concentration en protéines du surnageant et diluez les aliquotes à 15 milligrammes par millilitre avec de l’hydroxyde de césium de bicine de 50 millimolaires ou de l’hydroxyde de sodium de bicine de pH 7,8, contenant du césium ou du chlorure de sodium de 50 millimolaires. Préparez 500 microlitres de solutions de réservoir pour trois plaques de descente à 24 puits dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre. Variez la concentration de PEG 8 000 et de spermine, et modifiez le pH du tampon comme décrit dans le manuscrit pour chaque série.

Bouchez les tubes et faites tourbillonner vigoureusement pendant 10 secondes, avant de les centrifuger à 10 000 fois g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius pour éliminer les bulles d’air. Distribuez 500 microlitres de cette solution dans chaque réservoir. Versez cinq microlitres de solution protéique à 15 microgrammes par litre dans chaque puits de goutte assis à l’aide d’une micropipette P-10.

Ajoutez ensuite cinq microlitres de chaque solution réservoir correspondante à la goutte de protéines. Évitez les bulles d’air pendant le mélange et ne pipetez pas de haut en bas. Enfin, couvrez la plaque avec du ruban adhésif transparent et rangez-la à 25 degrés.

Les cristaux apparaissent en deux à cinq jours et atteignent leur pleine dimension en deux semaines. Ce protocole a été utilisé pour sous-cloner la sous-unité alpha et la sous-unité bêta de la tryptophane synthase de Salmonella typhimurium dans le vecteur pET SUMO modifié. Les résultats représentatifs SDS-PAGE de deux bandes fortes correspondant à la protéine de fusion tryptophane synthase His6-SUMO-alpha et His6-SUMO-beta sont présentés ici.

Chaque protéine a été purifiée par chromatographie d’affinité de l’acide nickel-nitrilotriacétique et précipitation du sulfate d’ammonium, suivie d’un clivage du marqueur His-SUMO, de l’élimination des traces du marqueur His-SUMO et de la mesure de la concentration en protéines. Le profil d’élution de la sous-unité alpha, de la sous-unité bêta et du complexe alpha-deux bêta-deux tryptophane synthase de Salmonella typhimurium sur SEC, ainsi que la pureté de leurs fractions de pic sont présentés ici. Après avoir généré des formes mutantes du complexe tryptophane synthase, le fractionnement du sulfate d’ammonium a été utilisé pour éliminer les protéines contaminantes du système d’expression hétérologue.

Un profil d’élution représentatif avec une position d’élution relative du complexe alpha-deux bêta-deux Salmonella typhimurium tryptophane synthase sur une colonne de chromatographie d’exclusion est présenté ici. La pureté des fractions de pic exclues a été analysée à l’aide de SDS-PAGE avant la mise en commun. De gros monocristaux ont été obtenus grâce à une optimisation fine de la cristallisation en faisant varier les concentrations de PEG 8 000 et de spermine et le pH tampon de bicine.

Des cristaux de morphologies différentes sont apparus en deux à cinq jours et ont atteint leur taille maximale en deux semaines. La validation des cartes de densité électronique pour la structure cristalline du complexe tryptophane synthase de Salmonella typhimurium alpha-deux de type sauvage a été élucidée après raffinement de la structure cristalline. Lors de l’exécution de ce protocole, complétez les étapes initiales de purification à température ambiante dès que possible pour éviter la perte d’activité de la tryptophane synthase.

Les structures cristallines des mutants devraient fournir de nouvelles informations sur le mécanisme et les rôles joués par les résidus clés dans la synthèse du L-tryptophane.