Insertion co-translationnelle de protéines membranaires dans des nanodisques préformés

Le protocole est très efficace et polyvalent. Il peut être appliqué à presque toutes les protéines membranaires, et l’ensemble du processus de production est terminé en une journée. Les protéines membranaires synthétisées peuvent être stabilisées déjà de manière co-traductionnelle par des ligands fournis.

Les contacts avec les détergents sont complètement évités, et les protéines s’insèrent et se plient directement dans les environnements membranaires fournis et adaptés. Les approches structurelles, la caractérisation fonctionnelle et la génération d’anticorps sont des domaines d’application privilégiés. De plus, la technique est simple pour analyser les effets lipidiques sur le repliement et la fonction des protéines membranaires.

Le troisième jour de la culture, inoculer 10 litres de milieu YPTG stérile à 37 degrés Celsius dans un réacteur à cuve agitée de 15 litres avec 100 millilitres de pré-culture. Et cultivez les bactéries à 37 degrés Celsius avec 500 tours par minute en haute aération. Pour éviter une formation excessive de mousse, ajoutez de l’anti-mousse stérile.

Lorsque les cellules atteignent la phase mi-logarithmique, ajoutez 300 millilitres d’éthanol à la culture et incubez les cellules à 42 degrés Celsius avec 500 rotations par minute en haute aération pendant 45 minutes supplémentaires. A la fin de l’incubation, récoltez les cellules par centrifugation, et à l’aide d’une spatule et d’une pipette pour remettre complètement les cellules en suspension dans 300 millilitres de tampon S30A. Centrifugez les bactéries remises en suspension deux fois, en lavant le granulé avec 300 millilitres de S30A frais par lavage.

Après le deuxième lavage, remettez les cellules en suspension dans un volume de 1,1 volume de tampon S30B. Chargez la suspension dans une cellule de pression à presse française pré-refroidie et perturbez une fois les cellules à 1 000 livres par pouce carré. Pour éliminer tous les composants instables et libérer l’ARNm des ribosomes, ajustez le lysat à 0,4 molaire de chlorure de sodium et incubez l’échantillon pendant 45 minutes dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.

Pour assembler les nanodisques de protéines d’échafaudage membranaire, mélangez la solution MSP1E3D1 avec la solution lipidique et ajoutez du DPC à une concentration finale de 0,1 %. Ajustez la réaction au volume final approprié selon le tableau et incubez les réactions pendant une heure à 21 degrés Celsius sous une agitation douce. À la fin de l’incubation, pré-mouiller la membrane d’une cassette de dialyse avec un tampon de formation de disque et utiliser une seringue pour charger le mélange d’assemblage dans la cassette. Ensuite, dialysez la réaction contre trois volumes de cinq litres de tampon de formation de disque pendant 10 à 20 heures à température ambiante en agitant avant de transférer le mélange dans des unités de filtre centrifuge équilibrées par tampon de formation de disque avec une coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons.

Concentrez ensuite la réaction à au moins 300 micromolaires par centrifugation à l’aide d’un lecteur UV-Vis pour mesurer la concentration. Pour préparer une réaction acellulaire à échange continu de trois millilitres, équilibrez la membrane d’une cassette de dialyse de trois millilitres dans du tris-acétate de 100 millimolaires. Et utilisez une seringue pour transférer le mélange réactionnel dans la cassette.

À l’aide d’une seringue, retirez l’excès d’air du compartiment du mélange réactionnel et placez la cassette dans la chambre de dialyse. Remplissez la chambre avec 60 millilitres de mélange d’alimentation et placez le couvercle sur la chambre. Après avoir fixé le couvercle en place, incubez la chambre pendant 12 à 16 heures à 30 degrés Celsius en 200 tours par minute.

Pour préparer une installation de réaction acellulaire sans cellule de 60 microlitres pour le criblage des ions magnésium, ajoutez 60 microlitres de notre Master Mix 3X fraîchement préparé au mélange réactionnel et 825 microlitres au mélange d’alimentation. Et remplissez le mélange d’alimentation avec de l’eau. Après le vortex, ajoutez 825 microlitres de mélange d’alimentation dans chacun des trois puits d’une microplaque de 24 puits.

Coupez des tubes de dialyse en cellulose régénérée avec une coupure de poids moléculaire de 10 à 14 kilodaltons en morceaux d’environ 25 x 20 millimètres et stockez-les dans de l’eau enrichie de 0,05 % d’azoture de sodium. Avant d’assembler le récipient sans cellule d’échange de minicellules, utilisez un mouchoir en papier pour enlever tout excès d’eau des membranes de dialyse et placez un morceau de membrane sur chaque récipient. Fixez les membranes à l’aide d’un anneau en polytétrafluoroéthylène et transférez le mini-récipient dans un puits de mélange d’alimentation.

Ajouter les composants de poids moléculaire élevé au mélange réactionnel, comme indiqué dans le tableau, et mélanger par pipetage. Ajoutez 60 microlitres de mélange réactionnel dans le récipient de réaction, en prenant soin d’éviter les bulles d’air. Et enroulez deux feuilles de huit centimètres sur 10 d’un film thermoplastique d’étanchéité autour de la plaque de 24 puits.

Fixez le couvercle de la plaque de puits en place avec du ruban adhésif et placez la plaque à 30 degrés Celsius en 200 tours par minute avec agitation pendant 12 à 16 heures. Le lendemain matin, à l’aide d’une pointe de pipette, percez la membrane de dialyse au niveau du récipient sans cellules d’échange de mini-cellules et aspirez le mélange réactionnel. Transférez le mélange réactionnel dans de nouveaux tubes à centrifuger et centrifugez pour éliminer les précipités.

Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube. Ici, un impact représentatif des composés réactionnels de réglage fin sur le rendement final ou la qualité des protéines membranaires synthétisées est montré. Dans cette analyse, la synthèse globale et la solubilisation des nanodisques du récepteur adrénergique T-bêta-one étaient similaires dans toutes les compositions membranaires analysées.

En revanche, une variation beaucoup plus importante a été détectée dans la qualité du récepteur couplé aux protéines G synthétisées, l’activité la plus faible étant obtenue avec les lipides DMPC et POPC, et la plus élevée observée lorsque le DOPG et le POPG ont été appliqués. Pris ensemble, ces résultats indiquent que la charge du groupe lipidique de la tête ainsi que la flexibilité de la chaîne d’acides gras sont des modulateurs importants pour le repliement et l’activité de cette protéine membranaire cellulaire. La concentration finale en nanodisques peut également être un facteur important pour la qualité des protéines membranaires.

Par exemple, si la concentration du nanodisque est tamisée dans une plage de 3,75 à 60 micromolaires, une solubilisation complète du récepteur couplé aux protéines G est obtenue à environ 30 nanodisques micromolaires, ce qui donne un rapport protéine/nanodisque membranaire de un à trois. En revanche, une solubilisation complète de la protéorhodopsine peut être obtenue avec des nanodisques d’environ 10 micromolaires, ce qui donne un rapport protéorhodopsine/nanodisque de 10 pour un. Un pipetage précis et des composants de haute qualité sont certainement obligatoires.

Les étapes critiques de la préparation du lysat sont la récolte des cellules en phase mi-log et l’application de l’étape à haute teneur en sel. La technique réduit considérablement la complexité de la synthèse des protéines membranaires. Des cibles autrefois difficiles sont synthétisées efficacement, ce qui permet de travailler sur les structures moléculaires de protéines pharmaceutiquement pertinentes jusqu’alors inexplorées.