Name: Décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez la décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode préserve l'intégrité structurelle de la matrice extracellulaire et permet l'analyse biochimique à l'échelle submicronique.

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Nous remercions les professeurs Ivana Novak et Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Université de Copenhague) d’avoir fourni un accès au microscope. Ces travaux ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR et JTE); une bourse de doctorat de la Fondation Lundbeck (R286-2018-621; MR); le Conseil suédois de la recherche (2017-03389; MDP); la Société suédoise du cancer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, et 190007; MDP); Aide allemande contre le cancer (Deutsche Krebshilfe; RR); et la Société danoise du cancer (R204-A12454; RR).

Toutes les procédures incluses ici ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique réglementant la médecine expérimentale de l’Université de Copenhague et sont conformes à la législation danoise et européenne. Pour démontrer ce protocole, nous avons utilisé des souris femelles BALB/cJ âgées de 8 à 12 semaines et une souris femelle MMTV-PyMT âgée de 11 semaines.
REMARQUE: Éviter la contamination bactérienne de l’échafaudage ECM décellularisé donne le meilleur résultat d’imagerie et permet le stockage à long terme des échantillons. Il est donc important de garder toutes les étapes stériles. En tant que tels, tous les instruments et le matériel chirurgical, y compris la suture, la micro-suture, les solutions, les tubes, les connecteurs Luer et les cathéters, doivent être stériles. Les surfaces, y compris un plateau en polystyrène, doivent être désinfectées avec de l’éthanol à 70% et la perfusion doit de préférence être effectuée sous une hotte à écoulement laminaire. Toutes les procédures ont lieu à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Microchirurgie post-mortem
<ol><li>Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre à CO2 .<ol>
<li>Placez la souris dans une chambre de 4 L et commencez à remplir avec 100% de CO2, en commençant à 0,2 L / min pendant 2 min, en augmentant jusqu’à atteindre un débit de 0,8 L / min après 3 min. La souris devrait tomber inconsciente pendant les 2 premières minutes, puis la respiration devrait cesser (généralement autour de 5 minutes, mais le flux peut être maintenu si nécessaire). Confirmez le décès avant de passer à l’étape suivante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rasez le thorax, l’abdomen et le dos de la souris avec la tondeuse à cheveux et désinfectez avec de l’éthanol à 70%. Le rasage réduit considérablement le nombre d’artefacts en raison de la présence de poils sur des échantillons pour l’imagerie ou l’analyse biochimique.</li>
	<li>Épinglez la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses membres antérieurs et postérieurs, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie.</li>
	<li>À l’aide d’un motif droit Mayo, les ciseaux établissent un accès chirurgical avec une incision cutanée allant de la région sous-maxillaire au bas-ventre et dissèquent par voie sous-cutanée pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, coupez les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à motif droit, coupez le sternum le long des incisions précédentes, puis complétez une sternotomie en coupant le sternum le long de son long axe, puis élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire.</li>
	<li>À l’aide de micro-pinces à pointe ronde (ou micro-pinces Demont), excisez le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Cela révélera les principaux navires.</li>
	<li>À l’aide de la cautérisation, cautériser la veine cava descendante et, à l’aide de ciseaux à motif droit, couper l’œsophage.</li>
	<li>À l’aide de micro-pinces pointues, séparez les veines brachiocéphales et les artères carotides communes gauches et sous-clavières brachiocéphales du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation.</li>
	<li>À l’aide d’un porte-micro-aiguille, de micro-pinces pointues et d’une suture 9-0 placent les points de suture au-dessus de l’émergence des artères brachiocéphales, carotides communes gauches et sous-clavières gauches.</li>
	<li>Cautériser les veines brachiocéphales.</li>
	<li>Séparez les glandes salivaires sous-maxillaires le long de la ligne médiane pour exposer les muscles du cou et la trachée. Séparez les muscles pour exposer le ligament cricothyroïdien. À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament.</li>
	<li>Introduire un cathéter de 27 G dans la trachée et pousser délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches (c.-à-d. jusqu’à ce que la résistance au cathéter soit rencontrée, puis reculez de 3 mm). Attention à ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture 6-0, placez 3 points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.</li>
	<li>Sectionnez la souris à la hauteur de la 12e vertèbre thoracique. L’aorte descendante s’étend antérieurement à la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Séparez la moitié inférieure.</li>
	<li>Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture 9-0, placez 4 points de suture autour de l’aorte, en commençant à 5 mm sous la pointe du cathéter.</li>
</ol>2. Décellularisation
<ol><li>Connectez la souris à un système de pompe à l’aide de tubes en silicone et de connecteurs Luer. Perfuser avec de l’eau désionisée à 200 μL/min pendant 15 min. Maintenir ce débit pendant la décellularisation.</li>
	<li>Changer l’agent de perfusion à 0,5% de désoxycholate de sodium (DOC) dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant la nuit.</li>
	<li>Changer l’agent de perfusion en sulfate de dodécyle de sodium (SDS) à 0,1% dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant 8 heures.</li>
	<li>Perfuser avec de l’eau désionisée pendant la nuit pour laver les FDS et les DOC pendant 24 h.</li>
	<li>Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax à l’aide d’un ciseau incurvé et stockez-le dans un cryotube stérile avec de l’eau désionisée contenant 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 0,3 μM d’azoture de sodium à 4 °C. Les échafaudages ECM peuvent être conservés pendant au moins 12 semaines1. Si l’échafaudage est utilisé pour l’analyse biochimique (p. ex., spectrométrie de masse), congelez-le dans de l’azote liquide.</li>
</ol>3. Immunocoloration
<ol><li>Planifiez l’imagerie : déterminez l’anticorps primaire (ou les anticorps) et la combinaison d’anticorps secondaires conjugués par fluorescence pour qu’ils correspondent les uns aux autres et s’adaptent aux lignes laser du microscope à fluorescence.</li>
	<li>Bloquez l’échantillon en l’immergeant dans un cryotube contenant 6% (v/v) de sérum d’âne - 3% (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) pendant la nuit.</li>
	<li>Incuber avec des anticorps primaires (ou des anticorps) dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 h.</li>
	<li>Laver 5 fois pendant 1 h à chaque fois à 0,05% entre 20 dans PBS (PBST).</li>
	<li>Incuber l’échantillon avec des anticorps secondaires (ou anticorps) conjugués par fluorescence dans du sérum d’âne à 3% dans du PBS pendant 24 h.</li>
	<li>Laver 5 fois pendant 1 heure à 0,05% (PBST). Attendez 1 h entre chaque lavage.</li>
	<li>Ajouter l’eau désionisée et conserver à 4 °C à l’abri de la lumière directe. À ce stade, l’échafaudage est prêt à imager.</li>
</ol>4. Imagerie
<ol><li>Placez l’échantillon dans un plat à fond de verre et humidifiez-le avec deux gouttelettes de solution de stockage (PBS ou eau désionisée).</li>
	<li>Préparez l’objectif. Nous vous recommandons d’utiliser un objectif d’immersion dans l’eau.</li>
	<li>Inspectez l’échantillon à l’aide d’une lumière de fluorescence.</li>
	<li>Passez au contrôle de l’ordinateur. Allumez les lasers et ajustez l’intensité du laser, l’ouverture du sténopé, les longueurs d’onde des détecteurs, le gain, la résolution et le zoom. Définissez le nombre et la taille de l’étape pour z-stack et commencez l’acquisition. Nous recommandons d’utiliser l’excitation laser multiphotonique pour augmenter la pénétration des tissus et minimiser la diffusion de la lumière, le blanchiment et les dommages tissulaires.</li>
</ol>5. Coloration à l’hématoxyline-éosine
<ol><li>Excise 1 lobe pulmonaire d’une souris euthanasiée.</li>
	<li>Placer dans un cryomoulage de 10 mm x 10 mm x 5 mm et le recouvrir d’environ 500 μL de composé OCT.</li>
	<li>Congeler sur de la glace carbonique (-70 °C) et maintenir l’échantillon à cette température.</li>
	<li>Exciser un lobe pulmonaire décellularisé d’une souris traitée conformément à l’étape 2.5.</li>
	<li>Placez dans un cryomoulage avec la plus grande surface vers le bas et recouvrez-le de composé OCT comme spécifié à l’étape 5.2.</li>
	<li>Lyophiliser sur de la glace carbonique (-70 °C) et maintenir l’échantillon à cette température jusqu’à ce qu’il en soit autrement. L’échantillon peut être conservé pendant au moins 12 semaines.</li>
	<li>Couper les blocs de tissu congelé à -20 °C dans un cryostat de 5 μm d’épaisseur et placer des sections sur des lames de verre adhésif et les stocker à -80 °C.</li>
	<li>Porter les lames à température ambiante jusqu’à séchage à l’air (environ 20 min).</li>
	<li>Immergez-vous rapidement dans pbS et fixez en immergeant les lames dans 4% de paraformaldéhyde dans pbS pendant 15 min. Laver une fois dans du PBS pendant 5 min, puis deux fois dans de l’eau distillée pendant 5 min.</li>
	<li>Plonger dans la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 10 min. Ce temps peut être optimisé en fonction de la source tissulaire et de la préparation des taches.</li>
	<li>Laver dans un pot Coplin sous eau distillée courante pendant 10 min.</li>
	<li>Immerger dans une solution d’éosine pendant 7 min. Ce temps peut être optimisé en fonction de la source tissulaire et de la préparation des taches.</li>
	<li>Tremper dans 50% d’éthanol pour éliminer l’excès d’éosine et déshydrater en trempant rapidement dans 70% d’éthanol, et dans 96% et 100% d’éthanol pendant 30 secondes. Tremper dans le xylène plusieurs fois.</li>
	<li>Appliquez quelques gouttes de support de montage DPX et placez un couvercle en verre.</li>
	<li>Laissez sécher les lames pendant la nuit sous une hotte chimique.</li>
	<li>Numérisez des diapositives dans un scanner de diapositives.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les techniques de décellularisation basées sur l’agitation tissulaire modifient la structure de l’ECM, ce qui les rend impropres à l’analyse de la structure de l’ECM4. La décellularisation par perfusion, utilisant une voie anatomique telle que l’aorte de la trachée, permet d’atteindre le lit capillaire, ou alvéole terminale, et facilite l’administration d’agents décellularisants dans tout l’organe. L’utilisation de détergents zwittérioniques, anioniques et non ioniques pour décellulariser les tiss...

L’ECM est un réseau tridimensionnel composé de protéines et de glycanes qui accueille toutes les cellules d’un organisme multicellulaire, donnant aux organes leur forme et régulant le comportement cellulaire tout au long de la vie1. À partir de la fécondation des ovules, les cellules construisent et remodèlent l’ECM, et sont à leur tour strictement contrôlées par celui-ci. Le but de ce protocole est d’ouvrir la voie à l’analyse et à la cartographie de l’ECM de la souris, car les souris sont l’organisme modèle le plus utilisé en physiopathologie des mammifères.
Le développement de cette méthode a été motivé par la nécessité de caractériser et d’isoler l’ECM2 natif associé aux métastases. Comme les tumeurs manquent de vascularisation anatomique appropriée et que les souris sont des organismes relativement petits, les procédures microchirurgicales ont été conçues pour cathétériser rétrogradement l’aorte, tout en isolant la circulation du vaisseau majeur menant à une tumeur (par exemple, les veines pulmonaires), concentrant ainsi le flux de réactif et permettant la décellularisation tumorale. Cette méthode produit des échafaudages ECM avec une structure conservée2 qui peut être immunocolorée et imagée, permettant une cartographie de la structure ECM dans des détails submicroniques. Pour réaliser ce protocole, il est nécessaire d’acquérir des compétences chirurgicales et microchirurgicales (dissection, microsuturing et cathétérisme) qui peuvent représenter une limitation potentielle à son utilisation. À notre connaissance, cette méthode représente l’état de l’art pour l’analyse d’imagerie de structure ECM native2,3.

<table><tbody><tr><td>MICROSURGERY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture, aiguille à section triangulaire (Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 micro-suture (Safil)</td><td>B Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince Adson avec dents</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micro-aiguilles Castroviejo</td><td>Fine Science Tools</td><td>n° 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 chambre de ventilation pour l’euthanasie des souris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau déminéralisée (Milli-Q IQ 7000, système d’eau de laboratoire ultrapure)&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Plateau jetable en polystyrène (~30 &times ; 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection (Greenough, avec col de cygne à deux bras)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>Microspatule à double extrémité</td><td>Outils de science fine</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Micropince Dumont (deux)</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Micropince Dumont avec 45&deg ; pointes (deux)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse à cheveux</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille Halsey (avec mâchoires en carbure de tungstène)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter intraveineux de calibre 24 (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter intraveineux de calibre 26 (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Mayo (coupe dure, droite)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>Micropinces à pointes annelées (deux)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à micro-ressort (Vannes, courbes)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles (calibre 27 ; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>Serviette en papier (stérile) ou serviette chirurgicale&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux dentelés (CeramaCut, droits)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Spatule (Freer-Yasargil)</td>Seringues <td>Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL ; Seringues</td> <td>3021001</td><td></td>Plastipak)<td>BD</td></tr><tr><td>(10 mL ; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à tendons (Walton)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-cochon d’Inde IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 âne anti-lapin IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumine bovine fraction V, grade standard, lyophilisée)&nbsp ;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV Anticorps polyclonal (RRID : AB_2276457)&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>Hôte : PBS de lapin</td></tr><tr><td>(pH 7,4, 10 fois ;, Gibco)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Hôte :</td></tr><tr><td>anticorps polyclonal Periostin de chèvre (un aimable cadeau de Manuel Koch. RRID :AB2801621)</td><td></td><td></td><td>Hôte : cochon d’Inde</td></tr><tr><td>Scalpel jetable avec lame n° 11 (pc. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>Sérum (sérum d’âne normal)&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Détecteurs (détecteurs hybrides (Leica, modèle HyD S) et tubes photomultiplicateurs (PMT ; )&nbsp ;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Source lumineuse à fluorescence</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>° Microscope (microscope multiphotonique inversé)&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Objectif (bleu lambda, 20 fois, ouverture numérique 0,70 (NA) IMM UV)&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Ti&ndash ; à deux photons laser saphir (Spectra-physics, modèle Mai Tai DeepSee)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Laser à lumière blanche (CMR)&nbsp ;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>DÉCELLULARISATION</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % Éthanol (alcool absolu 99,9 %) ; l’alcool absolu doit être ajusté à 70 % (vol/vol) en utilisant de l’eau déminéralisée&nbsp ;</td>Eau déminéralisée <td>1680766</td><td></td> <td>prune</td></tr><tr><td>(Milli-Q IQ 7000, système d’eau de laboratoire ultrapure)&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Raccords mâles Luer-tube (1/8 pouce)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10 fois ;, Gibco)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique (avec 12 canaux)</td><td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone (avec 2 mm de diamètre intérieur et 4 mm de diamètre extérieur)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium (DOC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H& E STAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 % PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96 % Ethanol</td><td>Plum</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Plum</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (24x50mm ; 1000 pcs)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm ; 100 pcs)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX support de montage</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution alcoolique 0,5 %</td><td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Feather microtome lame acier inoxydable,C35 (50 pièces)</td><td>Pfm medical</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Superfrost Plus lames (25 x 75 mm ; 144 pièces)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>Mayers hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de lames (Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Nous présentons ici un protocole de décellularisation pour le cœur et les poumons des souris. Il produit des échafaudages ECM structurels qui peuvent être utilisés pour analyser la topologie et la composition ECM. Il est basé sur une procédure microchirurgicale conçue pour cathétériser la trachée et l’aorte d’une souris euthanasiée afin de perfuser le cœur et les poumons avec des agents décellularisants. Le complexe cardiopulmonaire décellularisé peut ensuite être immunocoloré pour révéler l’emplacement des protéines ECM structurelles. L’ensemble de la procédure peut être complété en 4 jours.
Les échafaudages ECM résultant de ce protocole sont exempts de distorsions dimensionnelles. L’absence de cellules permet l’examen structurel des structures ECM jusqu’à une résolution submicronique en 3D. Ce protocole peut être appliqué aux tissus sains et malades de souris aussi jeunes que 4 semaines, y compris des modèles murins de fibrose et de cancer, ouvrant la voie à la détermination du remodelage ECM associé à la maladie cardiopulmonaire.

Décellularisation cardiopulmonaire Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur et les poumons, ainsi que le tissu annexe tel que l’arc aortique, seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline-éosine (Figure 1) des échafaudages ECM montrant l’élimination des noyaux par rapport au tissu natif. Ces échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa structure ECM insolub...

Ce protocole vise à décellulariser le cœur et les poumons des souris. Les échafaudages de matrice extracellulaire (ECM) qui en résultent peuvent être immunocolorés et imagés pour cartographier l’emplacement et la topologie de leurs composants.

Décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Ce protocole est la passerelle vers la matrice extracellulaire. Sa complexité et sa structure jusqu’à l’échelle submicronique. Le principal avantage de cette méthode est donc qu’elle permet d’obtenir une matrice extracellulaire qui conserve son intégrité structurelle ouvrant ainsi la voie à l’analyse biochimique et anatomique.Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten et Maria Rafaeva, actuellement dans mon laboratoire et Chris Madsen et qui était dans mon laboratoire et a continué le travail à l’Université de Lund, feront la démonstration de la procédure. Commencez par raser le thorax, l’abdomen et le dos de la souris euthanasiée avec une tondeuse à cheveux. Désinfectez la zone avec de l’éthanol à 70%.Épinglez ensuite la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses quatre membres postérieurs d’extrémité, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie. À l’aide d’un ciseau à motif droit Mayo, faites une incision cutanée allant de la région sous-mandibulaire au bas-ventre et disséquez par voie sous-cutanée pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.Utilisez ensuite des ciseaux microchirurgicaux pour couper les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique. Coupez le sternum le long des incisions précédentes avec des ciseaux à motif droit. Complétez ensuite une sternotomie en coupant le sternum le long de son long axe.Élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire. Utilisez des micro-pinces à pointe ronde pour exciser le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Et coupez l’œsophage avec des micro-ciseaux.Séparer les veines brachiocéphales et l’artère brachiocéphale à l’aide de micro-pinces pointues. Ensuite, séparez les artères carotide commune gauche et sous-clavière gauche du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation. Utilisez un porte-micro-aiguilles et des micro-pinces pointues et une suture de neuf oh pour placer des points de suture au-dessus de l’émergence des artères carotides communes gauches et sous-clavières gauches brachiocéphales, cautériser les veines brachiocéphales.À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament. Introduisez un cathéter de calibre 27 dans la trachée et poussez délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches, en prenant soin de ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture six O, placez trois points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.Sectionnez la souris à la hauteur de la 12ème vertèbre thoracique, l’aorte descendante court antérieurement à la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture, placez quatre points de suture autour de l’aorte, en commençant cinq millimètres sous la pointe du cathéter.Connectez la souris à un système de pompe à l’aide de tubes en silicone et de connecteurs inférieurs. Perfuser avec de l’eau désionisée à 200 microlitres par minute pendant 15 minutes. Ensuite, changez l’agent de perfusion à 0,5% DOC, dilué dans de l’eau désionisée et perfusez pendant la nuit.Le lendemain, changez l’agent de perfusion à 0,1% SDS dilué dans de l’eau désionisée et perfusez pendant huit heures. Ensuite, perfuser avec de l’eau désionisée pendant 24 heures pour laver la FDS et le DOC. Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax.Conservez le tissu dans un tube cryogénique stérile dans de l’eau désionisée avec 1% de streptomycine de pénicilline et 0,3 azoture de sodium micromolaire à quatre degrés Celsius. Pour effectuer une coloration immunologique, bloquez l’échantillon en l’incubant dans un tube cryogénique contenant 6% de sérum d’âne et 3% de BSA pendant la nuit. Ensuite, incuber avec un anticorps primaire dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 heures.Après l’incubation, lavez l’échantillon cinq fois dans du PBST pendant une heure par lavage. Incuber l’échantillon avec un anticorps secondaire conjugué par fluorescence dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 heures. Répétez ensuite les lavages dans PBST.Ajouter l’eau ionisée et conserver l’échantillon à quatre degrés Celsius de la lumière directe. Pour imager l’échantillon, placez-le dans un plat à fond de verre et humidifiez-le avec deux gouttelettes de solution de stockage. Définissez l’objectif et inspectez l’échantillon à l’aide de la lumière de fluorescence.Passez au contrôle informatique, allumez les lasers et ajustez l’intensité du laser, l’ouverture du sténopé, la longueur d’onde des détecteurs, le gain, la résolution et le zoom. Définissez le nombre et la taille de l’étape pour la pile Z, puis commencez l’acquisition. Excisez un lobe pulmonaire d’une souris euthanasiée et placez-le dans un moule cryogénique de 10 x 10 x cinq millimètres.Couvrez-le avec environ 500 milles de microlitres de composé OCT et congelez-le sur de la glace carbonique. Maintenez l’échantillon à cette température. Excisez un lobe pulmonaire décellularisé d’une souris traitée, placez-le dans un moule cryogénique avec la plus grande surface vers le bas et recouvrez-le de composé OCT.Congelez l’échantillon sur de la glace carbonique et maintenez-le à cette température jusqu’à ce qu’il en soit autrement. L’échantillon peut être conservé pendant au moins 12 semaines. Utilisez un cryostat pour sectionner des blocs de tissus congelés en cinq sections micrométriques à moins 20 degrés Celsius.Et placez les sections sur des lames de verre adhésif. Transférer les lames à température ambiante jusqu’à ce qu’elles sèchent à l’air. Immergez brièvement les diapositives dans PBS, suivies de 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 15 minutes.Laver une fois dans du PBS, puis deux fois dans de l’eau distillée pendant cinq minutes par lavage. Immergez les lames dans la solution d’hématoxyline de Myer pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames dans un pot Copeland sous de l’eau distillée courante pendant 10 minutes et immergez-les dans une solution d’éosine pendant sept minutes.Tremper dans le xylène plusieurs fois. Appliquez quelques gouttes de support de montage DPX et placez un couvercle en verre. Laissez les lames sécher pendant la nuit sous une hotte chimique, puis scannez-les dans un scanner à diapositives.Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur, les poumons et le tissu NX seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline éosine des échafaudages ECM. Les échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa structure ECM insolable est intacte.Les échafaudages ECM ont montré une perméabilité accrue et une pénétrabilité légère. L’utilisation de ce protocole avec un étage de microscope motorisé permet une imagerie en mosaïque tridimensionnelle d’échantillons de montage entiers à une résolution inférieure au micron. Il est essentiel d’éviter le flux vers les organes d’intérêt pour obtenir une décellurisation uniforme complète.La dissection microchirurgicale et la ligature des vaisseaux doivent être efficaces. Et en même temps respecter les tissus cibles pour maintenir la structure VCM native. Suite à cette procédure, les échafaudages seront enrichis pour les protéines ECM structurelles et pourront être utilisés pour la spectrométrie de masse ou l’ingénierie tissulaire.Cette technique ouvre la voie à la cartographie à haute résolution de la matrice extracellulaire.

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Recherche sur le cancer

Cette vidéo présente une méthode de production d’échafaudages à matrice extracellulaire décellularisée ou ECM en appliquant une perfusion antérograde de détergents à travers le système vasculaire. Les échafaudages structurels de la MEC peuvent ensuite être utilisés pour analyser le remodelage de la MEC associé aux maladies cardiopulmonaires.

Décellularisation du complexe cardio-pulmonaire : une technique de décellularisation du cœur et des poumons à partir d’un modèle murin

Une méthode pour rapidement et complètement éliminer les composants cellulaires à partir d'un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde est décrite. Cette méthode permet d'obtenir un site spécifique de la matrice extracellulaire cardiaque échafaudage qui a le potentiel pour être utilisé dans de multiples applications cliniques.

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

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Décellularisation et recellularisation pulmonaires de primates non humains à l’aide d’un bioréacteur spécialisé à grands organes

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L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.

Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

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Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro

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DÉCELLULARISATION du cœur humain à l’intérieur d’une poche sous pression dans une Orientation inversée

Classiquement, l’endocarde de la valve embryonnaire de souris primordium a été analysé en utilisant des coupes transversales, coronales ou sagittales. Notre nouvelle approche pour l’imagerie bidimensionnelle en face de l’endocarde dans les régions valvulogéniques permet une analyse de polarité plane et de réarrangement cellulaire de l’endocarde pendant le développement valvulaire.

En face Préparation d’un coussin endocardique pour l’analyse de morphogenèse planaire chez des embryons de souris

Ce protocole démontre l’isolement guidé par microscopie et la coloration par immunofluorescence des veines pulmonaires murines. Nous préparons des échantillons de tissus contenant l’oreillette gauche, les veines pulmonaires et les poumons correspondants et les colorons pour la troponine T cardiaque et la connexine 43.

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Transplantation de poumon issu de la bio-ingénierie à l’aide de poumons de souris décellularisés et de cellules endothéliales humaines primaires

Découvrez la décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode préserve l'intégrité structurelle de la matrice extracellulaire et permet l'analyse biochimique à l'échelle submicronique.

Décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin

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