Name: Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez l'empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour l'analyse structurelle des protéines. Cette méthode améliore la reproductibilité et la sécurité des études d'oxydation protéique rapide.

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Ces travaux ont été financés par l’Institut national des sciences médicales générales (R43GM125420 et R44GM125420).

1. Installation du tube capillaire
<ol><li>À l’aide d’une pierre clivante de silice, cliver 250 μm diamètre intérieur (ID) capillaire de silice à 27 pouces. Vérifiez les extrémités capillaires pour une coupe propre et droite.</li>
	<li>Créez deux fenêtres d’environ 15 mm de longueur en brûlant le revêtement en polyimide. À partir de l'«extrémité inférieure », la première fenêtre de photolyse est éloignée de 90 mm de l'«extrémité inférieure » et la deuxième fenêtre de dosimètre à 225 mm de l'«extrémité inférieure ». REMARQUE: Une fois que le revêtement est brûlé, le capillaire est très fragile.</li>
	<li>Dévissez l’écrou et la virole au port 5 et insérez l'«extrémité inférieure » du capillaire juste au-delà de l’extrémité conique de la virole(figure 1A).</li>
	<li>Sur le module de photolyse, retirez le capuchon de la cellule de photolyse en le tirant directement, puis retirez le masque métallique monté magnétiquement qui maintiendra le capillaire en place. ATTENTION: À l’intérieur du capuchon de la cellule de photolyse se trouve un miroir incurvé, ne laissez rien toucher le miroir.</li>
	<li>Sur le module du dosimètre, ouvrez la cellule du dosimètre en appuyant sur la languette à gauche et balancez la cellule du dosimètre ouverte vers la droite. Retirez les clips montés magnétiquement qui maintiendront le capillaire en place.</li>
	<li>Placez le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule de photolyse. Centrez la fenêtre capillaire avec la fenêtre de la cellule de photolyse. Tout en maintenant le capillaire en position d’une main, ajoutez le masque magnétique pour maintenir le capillaire en place. Replacez le bouchon de photolyse en position.</li>
	<li>Placez le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule du dosimètre. Centrez la deuxième fenêtre capillaire sur la petite ouverture au centre de la base de la cellule du dosimètre. Tout en maintenant le capillaire en position d’une main, placez les deux clips magnétiques en position pour maintenir le capillaire en place. Fermez la cellule du dosimètre jusqu’à ce qu’elle clique sur fermé.</li>
	<li>Insérez le capillaire à travers l’écrou moleté au sommet de l’ascenseur capillaire du collecteur du produit(Figure 1B). Étendre le capillaire juste au-dessus du fond du flacon. REMARQUE: Il est important que le capillaire atteigne le fond du flacon pour s’assurer que le capillaire est immergé dans la solution d’extinction lors de l’exécution d’une expérience.</li>
</ol>2. Installation d’une boucle d’injection
<ol><li>Utilisez un tube en téflon d’un diamètre extérieur de 1/16 po et d’un diamètre intérieur de 0,015 po (381 μm). Suivez l’équation 1 pour calculer la longueur des tubes nécessaires pour le volume désiré à l’aide de l’équation 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg"> Où L est la longueur du tube en millimètres, V est le volume désiré en microlitres et d est le diamètre intérieur du tube en millimètres. Pour un volume d’injection de 25 μL et un diamètre intérieur de 381 μm, la longueur du tube doit être d’environ 219,3 mm. NOTA : Pour les volumes inférieurs à 20 μL, utiliser des tubes en PTFE d’un diamètre intérieur de 0,01 ».</li>
	<li>Coupez le tube en téflon à la longueur nécessaire à l’aide d’un coupe-tube. Vérifiez les extrémités du tube pour une coupe propre et droite.</li>
	<li>Insérez une extrémité de la nouvelle boucle d’injection à travers l’un des écrous et placez une nouvelle virole sur l’extrémité du tube. Maintenez la virole et l’écrou en place et insérez le tube dans l’orifice 3 de la vanne d’injection jusqu’à ce qu’il fine dans la vanne. Tenez fermement le tube et serrez le doigt de l’écrou serré. À l’aide d’une clé, serrez l’écrou 1/4 tourner plus loin. Retirez et inspectez l’assembly. REMARQUE: Si la virole n’est pas fixée en position, réinstallez et serrez 1/8 tourner plus loin. Répétez l’opération avec l’autre extrémité de la boucle.</li>
	<li>Une fois que les deux extrémités ont un écrou et une virole fixe, visser lâchement une extrémité au port 3 et l’autre extrémité au port 6(Figure 1C). Une fois en position, serrez les deux côtés pour serrer les doigts serrés, puis 1/4 tournez devant le doigt serré avec une clé.</li>
</ol>3. Initialiser le système de photolyse
<ol><li>Allumez les modules de photolyse dans l’ordre suivant : (1) Module fluidique (2) Module photolyse (3) Module de dosimétrie (4) Collecteur de produits, et enfin (5) l’ordinateur système et lancer le logiciel de contrôle REMARQUE : Laissez le module de dosimètre au moins une demi-heure se réchauffer après un démarrage à froid.</li>
	<li>Tube complètement immergé de la position « Valve » sur la pompe de seringue(Figure 1D)dans 10 mL de tampon. Placer le tube de la position « Déchets »(figure 1D)et le tube de l’orifice 2 sur le port de seringue(figure 1C)dans un récipient vide pour collecter les déchets. REMARQUE: Utilisez le tampon dans lequel votre protéine sera suspendue. Un tampon recommandé est 10 mM NaPO4.</li>
	<li>Sur le carrousel Product Collector, placer des tubes microcentrifuges de 1,5 mL à la position marquée H et 6.</li>
	<li>Si vous utilisez un capillaire ID de 250 μm, réglez le débit de charge à 500 μL/min, le débit de traitement à 7,5 μL/min et le débit de déchets à 500 μL/min.</li>
	<li>Calculez le délai d’éclair, le temps de produit et le temps perdu pour utiliser le mode semi-automatique à l’aide de l’équation 2. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg"> Où t est le temps en minutes, s est la distance capillaire en millimètres, d est le diamètre intérieur du capillaire en millimètres et f est le débit en μL/min.<ol>
<li>Pour le délai d’éclair, la distance est d’environ 90 mm entre « l’extrémité inférieure » du capillaire et la première fenêtre. En utilisant un capillaire ID de 250 μm et un débit de traitement de 7,5 μL/min, l’échantillon arrivera à la fenêtre de photolyse en environ 35 secondes. Permettez à deux flashs à 1 Hz de se produire avant l’arrivée des échantillons, donc réglez le délai de flash à 33 secondes.</li>
		<li>Pour le temps du produit, entrez le temps que prendra la solution injectée pour s’écouler de la vanne d’injection à l’extrémité du capillaire. Pour un capillaire ID de 27 po de long de 250 μm, réglez la durée du produit sur 4,5 minutes.</li>
		<li>Pour la perte de temps, entrez le temps que le volume total de solution injecté prendra pour être collecté. À ce stade, le collecteur de produits passera de la position du produit au flacon de déchets. Pour un volume d’injection de 25 μL et un débit de 7,5 μL/min, réglez le temps perdu à 7,8 minutes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rincez la boucle d’injection cinq fois en injectant 25 μL d’eau de qualité HPLC dans l’orifice d’injection avec la vanne d’injection réglée sur la position de charge.</li>
	<li>Tournez manuellement la vanne d’injection jusqu’à la « position d’injection » pour rincer le reste du système. Sélectionnez Traiter (Out) sur le logiciel de contrôle pour commencer à couler de l’eau. Pendant qu’il coule, soulevez l’ascenseur capillaire du collecteur de produit en sélectionnant Vers le haut sous le collecteur de produits afin que vous puissiez voir la fin du capillaire. Faire circuler l’eau à travers le capillaire jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme. REMARQUE : Si une gouttelette ne se forme pas, vérifiez que la vanne de l’injecteur ne contient pas de fuites. En cas de fuite, desserrez l’écrou, réinstallez le capillaire et retentiez.</li>
</ol>4. Déterminer le rendement réel en ▪OH pour tester les effets de balayage radicalaire du tampon.
<ol><li>Dans le logiciel de contrôle, démarrez le flux en sélectionnant Processus (sortie). Dans l’onglet Paramètres, définissez la tension de flash sur 0 V. Sous l’onglet Contrôle manuel dans la section des données du dosimètre, sélectionnez Démarrer les données + AutoZero.</li>
	<li>Sélectionnez la position du flacon de produit (H) et du flacon de déchets (6).</li>
	<li>Sélectionnez Prêt, tournez manuellement la vanne d’injection vers le bas à la position de charge, et injectez 25 μL d’adénine 1 mM avec 100 mMH2O2 dans le port d’injection. Une fois injecté, tournez manuellement la valve d’injection jusqu’à la position d’injection. Remarque : Cela déclenche automatiquement le système pour commencer le flux, allumer la source de plasma et acquérir les données de dosimétrie.</li>
	<li>Augmentez la tension en accédant à l’onglet Paramètres et en modifiant la tension flash. Répétez les étapes 4.2 et 4.3 en utilisant 500 V, 750 V, 1000 V et 1250 V. Effectuez la lecture de l’absorbance de l’adénine à chaque tension en trois exemplaires.</li>
	<li>Sélectionnez l’onglet Calculs pour déterminer l’absorbance moyenne de chaque échantillon. Tout d’abord, cliquez sur Sélectionner, puis sélectionnez manuellement le début et la fin de l’absorbance maximale. Dans l’espace disponible, écrivez une description de l’exemple. Répétez l’opération pour toutes les données acquises. REMARQUE: Des bulles peuvent se former provoquant un pic dans la lecture du dosimètre. Lorsque vous sélectionnez des données pour déterminer l’absorbance moyenne, omettez les zones avec des bulles.</li>
	<li>Copiez et collez des données dans Excel pour calculer la variation moyenne de l’absorbance de l’adénine pour chaque tension, déterminant ainsi le rendement effectif ▪OH.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.1 à 4.6 si plusieurs conditions d’échantillonnage (différents tampons/additifs) sont utilisées pour normaliser le rendement efficace en ▪en OH pour chaque condition.</li>
</ol>5. Modification de la protéine pour détecter les changements dans la structure d’ordre supérieur.
<ol><li>Mélanger 4 mM d’adénine avec 20 μM de protéines dans un rapport de un à un pour obtenir une solution contenant 2 mM d’adénine et 10 μM de protéines.</li>
	<li>Faire la solution de trempe en utilisant 0,3 mg/mL de catalase pour décomposer l’excès de peroxyde d’hydrogène et 35 mM d’méthionine amide pour tremper les radicaux restants. Aliquote 25 μL de solution de trempe dans un microtube de 200 μL de sorte qu’un volume égal de trempe et le produit étiqueté soient mélangés.</li>
	<li>DiluerH2O2à 200 mM et garder sur la glace.</li>
	<li>Dans l’onglet Paramètres du logiciel de contrôle, démarrez la tension d’éclair à 0 V pour déterminer toute oxydation en arrière-plan.</li>
	<li>Dans l’onglet de contrôle manuel, sélectionnez Démarrer les données + AutoZero, suivi de Traiter (sortie),puis Prêt, et enfin baisser la vanne d’injection jusqu’à la position de charge.</li>
	<li>Placez une solution de trempe en position 1 sur le carrousel de collecte du produit. Sur le logiciel de contrôle du système, remplacez le flacon du produit par 1.</li>
	<li>Immédiatement avant l’injection, mélanger 12,5 μL du mélange d’adénine et de protéines avec 12,5 μL deH2O2pour obtenir une concentration finale de 1 mM d’adénine, 5 μM de protéines et 100 mMH2O2. Pipeter doucement de haut en bas pour mélanger, tourner rapidement vers le bas et injecter 25 μL à l’aide de l’orifice d’injection dans les 10 secondes suivant le mélange.</li>
	<li>Passez la vanne d’injection à la position d’injection et attendez pendant le traitement de l’échantillon.</li>
	<li>Répétez l’acquisition avec 500 V, 750 V, 1000 V et 1250 V. Effectuez chaque mesure de tension en trois exemplaires.</li>
	<li>Calculer l’absorbance moyenne telle que décrite à l’étape 4.5. Copiez et collez toutes les données dans Excel.</li>
</ol>6. Arrêtez le système
<ol><li>Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, rincer l’orifice de la seringue et la boucle de l’échantillon en fixant la valve d’injection à la position de charge et injecter 25 μL d’eau HPLC cinq fois.</li>
	<li>Tournez la vanne d’injection jusqu’à la position d’injection pour rincer le reste du système avec de l’eau HPLC.</li>
	<li>Arrêtez le flux, fermez le logiciel de contrôle du système, et éteignez les modules en commençant par le collecteur de produit, le module de dosimètre, le module de photolyse, puis enfin le module fluidique.</li>
</ol>7. Préparation de l’échantillon et chromatographie liquide-spectrométrie de masse
<ol><li>Dénaturer la protéine en incubant des échantillons à 80 °C pendant 20 min en présence de Tris 50 mM et de CaCl2 1mM. Refroidir les échantillons à température ambiante et ajouter 1:20 trypsine aux protéines. Digérer la protéine pendant la nuit à 37 °C avec mélange d’échantillons. Le lendemain matin, mettez fin à la digestion à la trypsine en chauffant les échantillons à 95 °C pendant 10 minutes.</li>
	<li>Détecter les peptides à l’aide d’un système LC-MS/MS haute résolution connecté à un système UPLC.</li>
	<li>Chargez d’abord l’échantillon sur la colonne du piège (300 μm ID X 5 mm 100 Å taille des pores, granulométrie 5 μm) et lavez à 5,0 μL/mL pendant 3 min avec de l’eau contenant 2 % de solvant B (acétonitrile et 0,1 % d’acide formique).</li>
	<li>Séparer les peptides sur une nanocolonne C18 (0,75 mm x 150 mm, granulométrie de 2 μm, taille des pores de 100 Å) à un débit de 300 nL/min avec un gradient entre le solvant A (eau contenant 0,1 % d’acide formique) et le solvant B. Le gradient pour l’élution peptidique consiste en une augmentation linéaire de 2 à 35% B sur 22 min, rampé à 95% B sur 5 min et maintenu pendant 3 min pour laver la colonne, puis retourné à 2% B sur 3 min et maintenu pendant 9 min pour rééquilibrer la colonne.</li>
	<li>Acquérir les données en mode ionique positif. Réglez la tension de pulvérisation à 2400 V et la température du tube de transfert d’ions à 300 °C.</li>
	<li>Acquérir les scans complets de MS de 250-2000 m/z suivis de huit balayages ms/ms dépendants des données suivants sur les huit ions peptidiques les plus abondants. Utilisez la dissociation induite par collision à 35% d’énergie normalisée pour fragmenter les peptides.</li>
	<li>Identifier tous les peptides non modifiés détectés lors de l’analyse MS/MS à l’aide d’un logiciel d’analyse des protéines disponible par rapport au fichier FASTA nécessaire contenant la séquence protéolytique et l’enzyme protéolytique pertinente.</li>
	<li>Rechercher et quantifier des peptides modifiés à l’aide d’un logiciel de traitement de données HRPF. L’étendue de l’oxydation pour chaque peptide identifié est calculée en divisant la surface de crête chromatographique additionnée d’un peptide modifié par la surface de crête chromatographique totale de ce peptide modifié et non modifié à l’aide de l’équation 3. P = [I(oxydé proprement) X 1 + I (doublement oxydé) X 2 + I(triplement oxydé) X 3 + .../[Non oxydé + I(oxydé proprement) + I(doublement oxydé) + I(triplement oxydé) ...] où P désigne le nombre moyen d’événements d’oxydation par molécule peptidique, et I représente la zone de crête du peptide non oxydé(non oxydé)et du peptide avec n événements d’oxydation.</li>
</ol>8. Pour une étude différentielle, répétez les étapes 5 à 7 sur la deuxième condition.
NOTA : Pour confirmer la reproductibilité, deux répétitions biologiques en plus des triples techniques pour chaque condition sont recommandées.

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<li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li>
</ol>

E.E.C., J.S.S. et S.R.W. divulguent une participation financière importante dans GenNext Technologies, Inc., une société en démarrage qui cherche à commercialiser des technologies pour l’analyse de la structure des protéines d’ordre supérieur. Les données représentatives fournies ont été examinées par S.K.M., qui n’a pas de conflit d’intérêts financier.

Il y a plusieurs étapes critiques pour assurer le bon étiquetage des protéines pendant toute expérience HRPF. Tout d’abord, un débit et un débit d’éclair à la source appropriés sont choisis pour s’assurer que chaque bolus de l’échantillon est irradié une fois. Cela garantit que la protéine est exposée à un seul bolus de ▪OH nouvellement formé. Une fois qu’une protéine est oxydée, la structure protéique d’ordre supérieur peut être modifiée. Pour être sûr que la structure protéique native est sondée, chaque molé...

La conformation des protéines et la structure d’ordre supérieur (HOS) associée sont les principaux déterminants de la bonne fonction biologique et du comportement aberrant1. Il en va de même pour les produits biopharmaceutiques, dont la structure et l’activité fonctionnelle dépendent de divers aspects de leur production et de leur environnement. Les changements biopharmaceutiques dans hos ont été liés aux réactions défavorables de drogue (ADR) attribuées à la pharmacologie indésirable et à la réponse immunologique patient2,3. L’apparition des ADR a alerté l’industrie biopharmaceutique sur le rôle essentiel que joue le HOS protéique dans la sécurité et l’efficacité des produits biothérapeutiques, et ils ont établi le besoin d’analyses HOS nouvelles et améliorées4.
L’empreinte des protéines radicales hydroxyles (HRPF) est une technique prometteuse pour suivre l’évolution de la protéine HOS. Hrpf implique le marquage irréversible de l’extérieur d’une protéine avec ▪OH suivi d’une analyse par spectrométrie de masse (MS) pour identifier la surface accessible au solvant de la protéine5,6,7. HRPF a été utilisé avec succès pour détecter des défauts dans la protéine HOS et sa fonction8,9,caractériser le HOS d’anticorps monoclonaux (mAb)10,11,12,13,déterminer la liaison Kd d’un ligand14,et bien plusencore 15,16,17,18,19. Une méthode courante pour générer l’OH ▪pour HRPF est l’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP), qui utilise des lasers UV rapides à haute énergie pour produire de l'▪OH à partir de la photolyse deH2O2. Pour la plupart, FPOP utilise des lasers excimer coûteux utilisant des gaz dangereux (KrF) qui exigent des garanties substantielles pour éviter les blessures respiratoires et oculaires20. Pour éviter les risques d’inhalation, d’autres ont utilisé des lasers grenat en aluminium à yttrium en néodyme quadruple de fréquence (Nd: YAG)21, qui éliminent l’utilisation de gaz toxiques mais sont toujours coûteux, nécessitent une expertise opérationnelle importante et exigent des contrôles de lumière parasite étendus pour protéger les utilisateurs contre les blessures oculaires.
Bien qu’il soit possible d’obtenir de nombreux renseignements à l’aide du HRPF, l’adoption à grande échelle dans le secteur biopharmaceutique n’a pas été respectée. Deux obstacles à l’adoption limitée du HRPF comprennent: 1) l’utilisation de lasers dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité substantielles20; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond des ▪OH qui limitent les études comparatives22. Pour supplanter l’utilisation du laser, une unité de photolyse flash plasma à haute vitesse et à haute énergie a été développée pour effectuer en toute sécurité le FPOP d’une manière facile. Pour améliorer l’irréprochabilité des expériences HRPF, une dosimétrie radicale en temps réel est mise en œuvre.
La pratique du HRPF a été limitée par l’irréprochabilité attribuée au nettoyage de fond de ▪OH22. Bien que les ▪OH soient d’excellentes sondes de la topographie des protéines, elles réagissent également avec de nombreux constituants présents dans les préparations, ce qui rend nécessaire de mesurer la concentration efficace de radical disponible pour oxyder une protéine cible. Les variations dans la préparation tampon, la concentration de peroxyde d’hydrogène, les propriétés de ligand, ou la photolyse peuvent avoir comme conséquence des différences d’oxydation entre le groupe témoin et le groupe expérimental qui créent l’ambiguïté dans des études différentielles hos. L’ajout de la dosimétrie radicale en temps réel permet l’ajustement de l’effet ▪charge OH et augmente donc la confiance et la reproductibilité lors d’une expérience HRPF. L’utilisation de la dosimétrie radicale dans le FPOP a été décrite ailleurs23,24,25,et est discutée plus en détail dans une publication récente26. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un nouveau système de photolyse flash et dosimétrie en temps réel pour étiqueter l’apo-myoglobine équine (aMb), en comparant les niveaux d’oxydation peptidique dans une expérience FPOP à celle obtenue lors de l’utilisation d’un laser excimer.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger coniques de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>n’importe quelle marque suffit</td></tr><tr><td>50 &micro ; L SGE Seringues étanches au gaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolonne (0,75 mm X 150 mm, 2 & micro ; m)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique (v/v), grade LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomyoglobine</td><td>Sigma-Aldrich</td> Catalase Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task</td><td>Wipers Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>n’importe quel peroxyde d’hydrogène à 30 % est suffisant</td></tr><tr><td>Microcentriuse</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spectromètre de masse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos</td> <td>Tribridd’autres instruments à haute résolution (par exemple Q exactive Orbitrap ou Orbitrap Fusion) peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>: Pierce, Trypsin, Protéase, MS Grade,</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>, Polymicro Cleave, 1 » x 1 » x 1/32 »</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>n’importe quel coupe-tube capillaire est suffisant</td></tr><tr><td>Eau UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>avec 0,1 % d’acide formique (v/v), Eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td>de qualité</tr><tr><td>LC/MS,</td> Fisher <td>Scientific</td><td>W6-4</td><td></td> de qualité LC</tr></tbody></table>

empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

L’empreinte des protéines du radical hydroxyle (HRPF) est une technique d’analyse structurelle d’ordre supérieur émergente et prometteuse qui fournit des informations sur les changements dans la structure des protéines, les interactions protéine-protéine ou les interactions protéine-ligand. HRPF utilise des radicaux hydroxyles(▪OH) pour étiqueter de manière irréversible la surface accessible au solvant d’une protéine. La complexité inhérente, le coût et la nature dangereuse de l’exécution du FPRH ont considérablement limité l’adoption à grande échelle dans la biopharmaceutique. Ces facteurs comprennent : 1) l’utilisation de lasers compliqués, dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité importantes; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond de ▪l’OH qui limitent les études comparatives. Cette publication fournit un protocole pour le fonctionnement d’un système HRPF sans laser. Ce système HRPF sans laser utilise une technologie d’oxydation flash de source de lumière plasma à haute énergie et à haute pression avec dosimétrie radicale en ligne. La source de lumière plasmatique est plus sûre, plus facile à utiliser et plus efficace pour générer des radicaux hydroxyles que les systèmes HRPF à base de laser, et le dosimètre radicalaire en ligne augmente la reproductibilité des études. Combiné, le système HRPF sans laser résout et surmonte les lacunes et les limites mentionnées des techniques laser.

La source de plasma à haute pression couplée à la dosimétrie en temps réel permet un meilleur contrôle de ▪rendement en OH pour observer plus précisément les changements dans la structure des protéines d’ordre supérieur. L’ajout d’adénine permet un dosimètre radicalaire efficace en temps réel. Lors de l’oxydation, l’adénine perd son absorbance UV à 265 nm(figure 2A). Le changement dans l’absorbance de l’adénine est directement lié à la concentration de radicaux disponibles pour HR...

Ce protocole présente une méthode pour utiliser la dosimétrie radicale en ligne et une source de lumière plasma pour effectuer l’empreinte des protéines d’oxydation flash. Cette méthode remplace le laser UV dangereux pour simplifier et améliorer la reproductibilité de l’oxydation photochimique rapide des études de protéines.

Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

L’empreinte des protéines de radical hydroxyle sans laser facilite grandement l’identification des sites d’interaction des protéines et des régions de changement de confirmation, accélérant la recherche dans les études d’agrégation, de structure et de stabilité des protéines. Avec la dosimétrie radicale en ligne, les utilisateurs peuvent ajuster la charge efficace de radicaux hydroxyles en temps réel, et avec la dosimétrie radicale en temps réel, vous pouvez économiser du temps expérimental et un échantillon précieux tout en améliorant la reproductibilité de l’étiquetage. Pour commencer, cliver un capillaire de silice de 250 micromètres de diamètre intérieur à 27 pouces avec une pierre de clivage de silice, en vérifiant les extrémités du capillaire pour une coupe propre et droite.Créez deux fenêtres d’environ 15 millimètres de longueur. À partir de l’extrémité inférieure du capillaire, brûlez le revêtement en polyimide de 90 millimètres pour créer la fenêtre de photolyse et de 225 millimètres pour la fenêtre du dosimètre. Insérez l’extrémité inférieure du capillaire juste au-delà de l’extrémité conique d’un écrou et d’une virole.Ajouter le capillaire à l’orifice cinq, serrant juste au-delà du doigt serré avec une clé. Retirez le capuchon de la cellule de photolyse du module de photolyse en le tirant directement, puis retirez le masque métallique monté magnétiquement, qui maintiendra le capillaire en place. Ouvrez la cellule du dosimètre en appuyant sur la languette à gauche et balancez la cellule du dosimètre ouverte vers la droite.Retirez les clips montés magnétiquement qui maintiendront le capillaire en place. Placez ensuite le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule de photolyse, et centrez la fenêtre capillaire avec la fenêtre de la cellule de photolyse. Maintenez le capillaire en position et ajoutez le masque magnétique.Replacez le bouchon de photolyse en position. Placez le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule du dosimètre et centrez la deuxième fenêtre capillaire sur la petite ouverture au centre de la cellule du dosimètre. Tout en maintenant le capillaire en position d’une main, placez les deux clips magnétiques en position pour maintenir le capillaire en place.Fermez la cellule du dosimètre jusqu’à ce qu’elle clique sur fermé. Enfin, insérez le capillaire à travers le bouton moleté au-dessus de l’ascenseur capillaire du collecteur de produit, en étendant le capillaire juste au-dessus du fond du flacon. Coupez la longueur souhaitée du tube en téflon à l’aide d’une fraise et vérifiez les extrémités pour une coupe droite propre.Insérez une extrémité de la nouvelle boucle d’injection à travers l’un des écrous et placez une nouvelle virole sur l’extrémité du tube. Maintenez l’écrou et la virole en place tout en insérant le tube dans l’orifice six de la vanne d’injection jusqu’à ce qu’il soit au fond. Serrez l’écrou avec une clé, puis confirmez que l’écrou et la virole sont solidement en place.Une fois que les deux extrémités ont un écrou et une virole fixe, vissez lâchement une extrémité à l’orifice trois et l’autre extrémité à l’orifice six. Une fois en position, serrez les deux côtés pour serrer le doigt, puis un quart de tour au-delà du doigt serré avec une clé. Allumez le système HRPF sans laser en démarrant le module fluidique, suivi du module de photolyse, du module de dosimètre, du collecteur de produit et de l’ordinateur système.Lancez le logiciel système. Submergez complètement le tube dans 10 millilitres de tampon à partir de la position de la vanne sur la pompe à seringue. Dirigez le tube de la position des déchets et le tube du port deux sur le port de seringue vers un récipient vide pour collecter les déchets.Placer des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à la position marquée HN6 sur le carrousel collecteur du produit. Rincez la boucle d’injection cinq fois en injectant 25 microlitres d’eau de qualité HPLC avec la vanne réglée sur la position de charge. Tournez manuellement la vanne d’injection pour rincer le reste du système.Sélectionnez Traiter sur le logiciel de contrôle pour commencer à couler de l’eau jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme. Faire une solution contenant deux adénine millimolaire et 10 protéines micromolaires. Ensuite, faites une solution de trempe en utilisant 0,3 milligrammes par millilitre catalase et 35 millimolaires d’amide de méthianine.Aliquote 25 microlitres de solution de trempe dans un microtube de 200 microlitres. Diluer le peroxyde d’hydrogène à 200 millimolaires, en le maintenant sur la glace. Démarrez la tension de flash à zéro volt sur le logiciel de contrôle.Ce contrôle zéro volt déterminera toute oxydation de fond sur la protéine d’intérêt. Sélectionnez Démarrer les données AutoZero, puis Traiter puis Prêt. Enfin, tournez la vanne d’injection jusqu’à la position de charge.Placez la solution de trempe en position un sur le carrousel collecteur de produit, puis changez le flacon de produit en un sur le logiciel de contrôle du système. Immédiatement avant l’injection, mélanger 12,5 microlitres du mélange d’adénine et de protéines avec 12,5 microlitres de peroxyde d’hydrogène. Pipetter le mélange de haut en bas pour mélanger, puis le faire tourner rapidement vers le bas.Injecter 25 microlitres de cette solution en utilisant le port d’injection dans les 10 secondes suivant le mélange. Passez la vanne d’injection à la position d’injection et attendez pendant le traitement de l’échantillon. Montez la tension de flash à 750 volts sur le logiciel de contrôle et répétez les étapes d’étiquetage.Notez ensuite l’absorbance de chaque échantillon. Tout d’abord, cliquez sur Sélectionner, puis sélectionnez manuellement le début et la fin de l’absorbance maximale. Dans l’espace disponible, écrivez une description de l’exemple.Répétez cette opération pour toutes les données acquises. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul pour calculer la variation moyenne de l’absorbance de l’adénine pour chaque tension. Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, rincer l’orifice de la seringue et la boucle de l’échantillon en fixant la valve d’injection à la position de charge et injecter cinq fois 25 microlitres d’eau HPLC.Tournez la vanne d’injection jusqu’à la position d’injection pour rincer le reste du système avec de l’eau HPLC. Une fois rincé, arrêtez le flux, quittez le logiciel de contrôle du système et éteignez les modules, en commençant par le collecteur de produits, le module de dosimètre, le module de photolyse et enfin le module fluidique. Lors de l’oxydation, l’adénine utilisée pour la dosimétrie diminue l’absorbance UV à 265 nanomètres.Le tampon 2 contient un extracteur radicalaire, ce qui diminue le changement d’absorbance de l’adénine par rapport au tampon 1. Apomyoglobin a été modifiée en présence du peroxyde d’hydrogène et de l’adénine à quatre tensions croissantes de lampe de plasma. Six peptides ont été détectés, avec une augmentation linéaire de l’oxydation par rapport au changement de l’absorbance de l’adénine à 265 nanomètres.Ces six peptides oxydés sont marqués sur une structure cristalline de myoglobine. L’étendue de l’oxydation détectée à partir de la lampe à plasma haute pression est beaucoup plus élevée que la méthode laser. Cette augmentation provient du spectre d’émission UV à large spectre de la lampe à plasma haute pression.En produisant un large spectre UV, la lampe à plasma haute pression chevauche mieux le domaine d’absorbance du peroxyde d’hydrogène, ce qui entraîne une production plus efficace de radicaux hydroxyles grâce à la photolyse du peroxyde d’hydrogène, par rapport au laser Kr F Excimer et au laser Nd YAG. La lampe à plasma haute pression augmente considérablement la production de radicaux hydroxyles au-delà de ce qui est généralement observé à l’aide d’un laser Excimer Kr F. L’utilisation de peroxyde 100 millimolaires peut provoquer des niveaux élevés d’oxydation de fond.Si le système protéique est sensible à l’oxydation induite par le peroxyde, diminuer la concentration jusqu’à 10 millimolaires. L’étiquette irréversible de HRPF permet la manipulation des échantillons en aval, y compris les longues digestions de protéase, vous pouvez ajouter une étiquette de masse en tandem pour le multiplexage et effectuer une chromatographie 2D, améliorant ainsi la détection des peptides et la coordination des informations structurelles.

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Ce protocole décrit comment quantifier les Mg (II)-dépendante de la formation de l'ARN structure tertiaire par deux méthodes d'empreinte radical hydroxyle.

Les changements d&#39;équilibre dans la structure de l&#39;ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

Mesure précise de la masse représente une étape importante lors de l'enquête de protéines. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) la spectrométrie de masse (MS) peut être utilisée pour cette détermination et son principal avantage est la tolérance aux sels, des détergents et des contaminants. Ici, nous illustrons une approche accessible pour l'analyse des protéines de plus de 100 kDa par MALDI-MS.

Soutenue par une matrice désorption / ionisation laser temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse Analyse des protéines intactes de plus de 100 kDa

conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

L’architecture des complexes protéiques est essentiel pour leur fonction. Combinant différentes techniques de spectrométrie de masse s’est avérée puissante pour étudier leur assemblage. Nous fournissons des protocoles pour la réticulation chimique et spectrométrie de masse native et montrer comment ces techniques complémentaires contribuer à élucider l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques.

Combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des Complexes de protéine intacte pour étudier l’Architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

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Un protocole de cryoslicing polyvalent BN-MS utilisant un microtome est présenté pour le profilage complexome à haute résolution.

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

In vivo l’oxydation photochimique rapide des protéines (IV-FPOP) est une technique d’empreinte de protéine radicale hydroxyl qui permet la cartographie de la structure des protéines dans leur environnement indigène. Ce protocole décrit l’assemblage et la mise en place du système de flux microfluidique IV-FPOP.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Ici, nous caractérisons la structure des protéines et les sites d’interaction dans les cellules vivantes à l’aide d’une technique d’empreinte protéique appelée oxydation photochimique rapide cellulaire des protéines (IC-FPOP).

Caractériser les protéines cellulaires avec l’oxydation photochimique rapide à cellule des protéines

L’oxydation photochimique rapide des protéines est une technique émergente pour la caractérisation structurelle des protéines. Différents additifs et ligands de solvant ont des propriétés de récupération radicales hydroxyles variées. Pour comparer la structure protéique dans différentes conditions, une compensation en temps réel des radicaux hydroxyles générés dans la réaction est nécessaire pour normaliser les conditions de réaction.

Permettre une compensation en temps réel dans les oxydations photochimiques rapides des protéines pour la détermination des changements de topographie des protéines

Les procédures expérimentales pour effectuer un marquage covalent à base de diéthylpyrocarbonate avec détection spectrométrique de masse sont décrites. Le diéthylpyrocarbonate est simplement mélangé avec la protéine ou le complexe protéique d’intérêt, conduisant à la modification des résidus d’acides aminés accessibles aux solvants. Les résidus modifiés peuvent être identifiés après digestion protéolytique et analyse chromatographie liquide/spectrométrie de masse.

Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Une nouvelle plate-forme statique est utilisée pour caractériser la structure protéique et les sites d’interaction dans l’environnement cellulaire indigène en utilisant une technique d’empreinte protéique appelée oxydation photochimique rapide des protéines (IC-FPOP).

Incubateur de plateformes avec Movable XY Stage: Une nouvelle plate-forme pour la mise en œuvre de l’oxydation photochimique rapide en cellule des protéines

Découvrez l'empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour l'analyse structurelle des protéines. Cette méthode améliore la reproductibilité et la sécurité des études d'oxydation protéique rapide.

Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines (Vidéo) | JoVE Journal

Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines

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