Procédé de perfusion antegrade pour l’isolement de cardiomyocytes de souris

Nous avons développé une méthode simple sans Langendorff pour isoler des cellules cardiaques de souris individuelles par une technique d’emballage antegrade. Cette méthode permet d’isoler les cellules cardiaques des souris juvéniles aux souris plus âgées. la perfusion rétrograde basée sur Langendorff a été considérée comme un étalon-or pour isoler les myocytes cardiaques chez divers animaux d’expérience.

Cependant, l’insulation de la LTA est techniquement difficile chez les souris en raison de leur petite taille. Pour la récolte du cœur de souris, après avoir confirmé l’euthanasie et rasé l’abdomen, ouvrez rapidement la cavité thoracique pour exposer le cœur et utilisez une pipette de transfert en plastique avec la pointe coupée à peu près à la taille du cœur pour aspirer le cœur dans la pipette. Soulevez la pipette pour créer suffisamment d’espace pour insérer des ciseaux incurvés et utilisez les ciseaux pour exciser le cœur du côté dorsal en prenant soin d’éviter d’endommager les oreillettes.

Immédiatement, placez le cœur dans un bécher en verre de 30 millilitres contenant de la glace CIB-EGTA pendant environ une minute. Lorsque les contractions ont cessé, placez le cœur dans un plat de culture de 35 millilitres contenant du CIB-EGTA glacé et retirez le poumon et d’autres tissus visibles. Placez le cœur grossièrement nettoyé sur un support de cœur rempli de côté apex CIB-EGTA réfrigéré vers le bas et placez le support sous un microscope stéréoscopique.

Enlever la graisse et les tissus conjonctifs autour de l’aorte. Si la longueur de l’aorte coupée est trop longue, coupez l’aorte juste sous l’artère brachiocéphalique et orientez le cœur de sorte que la surface antérieure soit tournée vers l’avant. Utilisez une pince à épiler pour soulever l’extrémité de l’aorte et utilisez une petite pince vasculaire pour serrer l’aorte près des oreillettes tout en poussant doucement sur les oreillettes.

Placez ensuite le cœur serré sur une plaque de perfusion avec la face antérieure vers le haut et hydratez le cœur avec quelques gouttes de CIB-EGTA. Pour la perfusion antegrade, chargez une seringue de 20 millilitres contenant du CIB-EGTA pré-feu connecté à un tube d’extension flexible et une aiguille d’injection marquée sur la pompe à perfusion et démarrez la pompe à un débit de 0,5 millilitre par minute. Lorsque l’aiguille et la pompe ont été remplies, placez l’aiguille d’injection sur la plaque de perfusion avec le côté le plus court de la forme diagonale à l’avant et faites glisser l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche simplement l’apex du cœur.

Insérez soigneusement l’aiguille près de l’apex du ventricule gauche dans la chambre ventriculaire sans tordre ou détacher l’aiguille de la plaque, en regardant la marque pour estimer la profondeur de l’insertion de l’aiguille. Lorsque l’insertion de l’aiguille est terminée, le sang devrait commencer à circuler de l’artère coronaire. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l’aiguille d’injection à la plaque et augmenter la vitesse de la pompe à un millilitre par minute.

Si le cœur est perfusé avec succès, le flux du tampon dans le capillaire doit être visible juste sous l’épicurium. Après deux à trois millilitres de perfusion CIB-EGTA, remplacez le tampon de perfusion par un mélange d’enzymes. Après avoir perfusé un à deux millilitres, augmentez la vitesse de la pompe à 1,5 millilitres par minute.

Utilisez une pipette pour enlever le perfusat contenant du sang accumulé qui s’écoule du cœur au besoin et arrêter la perfusion lorsque le volume total d’enzymes perfusés atteint 10 millilitres. À la fin de la perfusion, transférer 10 millilitres de mélange d’enzymes de la seringue vers une parabole de culture de 60 millimètres sur un tapis chauffant et ajouter 20 milligrammes de BSA à la parabole. Faire pivoter doucement le plat pour dissoudre la poudre et retirer l’aiguille d’injection et la pince du cœur.

Retirez les ventricules et les oreillettes du cœur et placez les tissus dans le mélange d’enzymes supplémenté par BSA. Pour isoler les myocytes ventriculaires, utilisez deux paires de pinces à épiler pour saisir l’épicardium et tirez doucement les ventricules en petits morceaux. Lorsque tous les fragments de ventricule ont été générés, dispersez les cellules environ 30 fois avec un pipetage doux et filtrez les débris non digérés à travers une passoire de cellules à mailles de 100 microns dans un tube de centrifugation de 15 millilitres.

Après centrifugation, ressuscitez la pastille de cardiomyocyte dans cib pré-envahi complété avec du calcium et BSA et incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, centrifuger à nouveau les cellules et remettre en suspension les cardiomyocytes précipités dans un volume approprié de solution de remise en suspension cellulaire pour leur maintien à 37 degrés Celsius jusqu’à l’analyse en aval. Pour isoler les myocytes atriaux, transférez les oreillettes à un récipient de CIB pré-prémédité complété avec du calcium et des BSA et déchirez les oreillettes en morceaux comme démontré.

Utilisez une pipette de 20 microlitres réglée sur 10 microlitres pour perturber les tissus par pipetage et recueillir les cellules dissociées par centrifugation. Puis ressusciter la cellule auriculaire dans un volume approprié de solution de remise en suspension cellulaire. Dans cette image, des myocytes ventriculaires fraîchement isolés peuvent être observés.

Cette procédure d’isolement a comme conséquence un rendement de 70 à 80% de myocytes ventriculaires tranquilles en forme de tige de huit à 10 souris week-old dans environ cinq heures d’isolement. Le rapport de cellules viables fraîchement isolées est plus faible chez les souris de plus de deux ans. Les potentiels d’action enregistrés dans les myocytes ventriculaires et auriculaires sont similaires à ceux mesurés dans les cellules obtenues par la méthode basée sur Langendorff.

L’analyse immunomarquante peut être utilisée pour évaluer l’organisation de la structure sarcomérique des myocytes ventriculaires et la transformation des fibroblastes cardiaques en myofibroblastes après sous-culture. L’analyse western blot est recommandée pour déterminer l’expression spécifique des protéines d’intérêt dans les oreillettes et les ventricules après traitement. Après perfusion avec des enzymes, les protéines des oreillettes et des ventricules peuvent être facilement homogénéisées dans le tampon de lyse avec la force légère pour l’extraction de protéine.

Il est important de contrôler la direction et les profondeurs de l’insertion de l’aiguille. Lors de l’insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche, veillez à ne pas percer le septum ventriculaire ou à pénétrer dans la valve. Vous pouvez modifier la composition du perfusate en fonction du but de l’expérience.

Par exemple, un détergent supplémenté à l’EGTA peut être utilisé pour fabriquer un échafaudage sans cellules du cœur.